雙光子顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子,，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,，發(fā)射一個波長較短的光子,；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域；因為信號背景比高,，所以具有更高的對比度；由于激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā),、光毒性小的特點；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，更加安全。雙光子顯微鏡的應用中,，該如何選擇以及更好的使用PMT,。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點,，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝,；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅,；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā),，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達到80至100兆赫茲,。激光熒光雙光子顯微鏡的成像視野如果已經(jīng)有了飛秒光,，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺，只需分光即可,。

雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術(shù),，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞或組織的深層觀察。它的主要特點是使用雙光子激發(fā)來產(chǎn)生熒光,，從而實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像,。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中,，激發(fā)出熒光,。這個過程需要使用一個特殊的雙光子激發(fā)源，它能夠?qū)⒁粋€光子轉(zhuǎn)換為兩個光子,，其中一個光子用于激發(fā)熒光,，另一個光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性,，可以實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像,，特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長較長,，能夠更好地穿透生物組織,，從而實現(xiàn)對深層細胞的觀察。熒光壽命長：雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長,，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標記物,。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低，因此對生物樣品的損傷較小,，可以減少光毒性,。總之,，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù),，可以用于生物學、醫(yī)學,、材料科學等領域的研究,。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標本改造,。關于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關于標本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理,。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解,，進而讓標本“透明度”提高,。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗,；ultima雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷

指示劑是如何負載細胞,，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法,，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經(jīng)元中,。此方法方便實驗者控制單個神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高,。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負載神經(jīng)元，觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導致一些膠質(zhì)細胞也被指示劑所標記,，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標記百分比,，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關性的活動。第三種也較為常用,，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑,。（A）單細胞注射法；（B）networkloading法,；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷