王愛民副教授結合工作實例,，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，重量只為2.2克，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部，可實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元,、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號，在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學研究和醫(yī)療領域應用有較大的應用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進行細胞和組織結構成像,，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠實時,、在體、原位,、無創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質組份的光譜特性，區(qū)分成像,；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標成像,，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光,、二次諧波,、熒光獲得活細胞生化信息。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用,。熒光雙光子顯微鏡授權供應商

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率,。進口ultima雙光子顯微鏡分辨率雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標本進行定點,、有生命體的觀察！

配合雙光子激發(fā)技術,，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么，什么是雙光子激發(fā)技術呢,？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術,。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光,，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，被光探頭接收，從而能夠達到逐點掃描的效果,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外,，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像,。雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例。

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關,，所以關鍵變量只剩下激光脈寬,。基于以上分析,，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像。進口ultima雙光子顯微鏡分辨率

這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍,。熒光雙光子顯微鏡授權供應商

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦）,，這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16,，降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質進行成像的研究,；熒光雙光子顯微鏡授權供應商