WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊?？茖W家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡,。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點,，那么雙光子顯微鏡有哪些應用呢,？國外investigator雙光子顯微鏡分辨率是多少

隨著技術的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造,。關于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡,，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞,，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,，而其頻率可以達到80至100兆赫,，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞,，使掃描能更好地進行,。美國ultima雙光子顯微鏡商家雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進行成像,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米,。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像,。

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術的空間分辨率，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率。雙光子顯微鏡品牌有哪些？

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力,，可以進行三維成像,、動態(tài)成像等。然而,，針空在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應,，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學散射,，其具體優(yōu)勢如下所述。如果已經(jīng)有了飛秒光,，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺,，只需分光即可。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

對于顯微成像技術包含：寬場熒光顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡,、轉盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡,。國外investigator雙光子顯微鏡分辨率是多少

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作和免維護的激光系統(tǒng)其輸出波長為920nm,，非常適合常規(guī)熒光基團(如GFP、eGFP,、曙紅、GCaMP,、CFP,、鈣黃綠素或金星)的雙光子激發(fā)。它可以為熒光基團提供相對較高的峰值功率,，常用于神經(jīng)科學和其他與激光相關的光子學,。此外，其獨特的設計(簡單和經(jīng)濟的光源)具有創(chuàng)新雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的潛力,。在雙光子顯微鏡中,，峰值功率就是亮度！如果你想獲得更好的圖像亮度,，那么你需要短脈沖,，高功率,，更重要的是，干凈的時間脈沖形狀,。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率,、短脈沖、獨特的Clean-Pulse技術和相對較高的峰值功率,，這使得在雙光子顯微鏡中實現(xiàn)****亮度而無需對樣品進行不必要的加熱成為可能,。FemtoFiberultra920全包式、完全集成的色散補償(可確保樣品處的短脈沖),、內(nèi)置電源控制,、直觀的操作及其堅固緊湊的設計使系統(tǒng)具有非常友好的用戶體驗，是非線性顯微鏡應用的良好解決方案,。例如,，熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機制國外investigator雙光子顯微鏡分辨率是多少