雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí),，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測(cè)效率。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴(lài)于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì),。國(guó)內(nèi)bruker雙光子顯微鏡的成像視野

臨研所,、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛(ài)民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持,。王愛(ài)民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評(píng)為2018年度“年度方法--無(wú)限制行為動(dòng)物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來(lái)即時(shí)病理,、離體組織檢測(cè)、術(shù)中診斷等提供新型的影像手段和分析方法,。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點(diǎn)偶然,，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來(lái)了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡,。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí),，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書(shū),，從中了解到非線(xiàn)性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí),，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒(méi)有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開(kāi)紫外，換言之,，與其通過(guò)一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過(guò)兩個(gè)雙倍波長(zhǎng)的可見(jiàn)光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn),。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建,，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。

有了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡可以發(fā)揮更好的作用,。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子，使電子躍遷到更高的能級(jí),。短時(shí)間后,，電子跳回到較低的能級(jí)，發(fā)出波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子(P=h/λ),。利用這個(gè)原理,，雙光子激發(fā)技術(shù)誕生了。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光通過(guò)物鏡會(huì)聚,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，物鏡焦點(diǎn)處的光子密度比較高，所以雙光子激發(fā)只能發(fā)生在焦點(diǎn)處產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光穿過(guò)物鏡,，被光學(xué)探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖光,，是通過(guò)物鏡匯聚的,。

    其實(shí)電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或者存在的比較大意義，準(zhǔn)確的來(lái)說(shuō),，不在于放大倍數(shù),，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的,。通俗的來(lái)說(shuō),，就是進(jìn)行觀察的時(shí)候，除了要將物體放大,，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開(kāi)來(lái),。如果兩個(gè)相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大到很大,，看到的可能卻是兩個(gè)相交的亮斑（艾里斑）,，而沒(méi)有明顯的界限（更不用說(shuō)細(xì)節(jié)了），這表示是分辨率不夠,。拋開(kāi)分辨率談放大倍數(shù)是沒(méi)有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，約等于光波波長(zhǎng)的一半,，通常被說(shuō)成是光學(xué)顯微鏡放大極限,，其實(shí)準(zhǔn)確地來(lái)說(shuō)，應(yīng)該叫做分辨率的極限,。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性,，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能,。電子顯微鏡也有多種，題主說(shuō)的是像REM的,。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的,，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)其周期性的特點(diǎn)而生成倒易空間里的衍射圖像,，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實(shí)空間，得到真正的晶體表面圖像了,。 雙光子顯微鏡除了可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝以外呢,，可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行成像。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 ,。國(guó)內(nèi)bruker雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過(guò)1毫米。另外,，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā),，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。國(guó)內(nèi)bruker雙光子顯微鏡的成像視野