后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7,、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況,，來驗證該光學系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性,。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間,，曝光間隔1s照射樣品,，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm,，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖,。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,，得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知,，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷,，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的,，所以預期細胞存活時間會更長,，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例,。國外ultima雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達到80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率,。美國布魯克雙光子顯微鏡代理商雙光子顯微鏡的應(yīng)用中,，該如何選擇以及更好的使用PMT。

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦）,，這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像的研究；

臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術(shù)報告,。學術(shù)報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學信息科學技術(shù)學院副教授,，畢業(yè)于北京大學物理系，獲學士,、碩士學位,，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新型的影像手段和分析方法,。于雙光子激發(fā)需要兩個光子同時到達，因此只有在焦點附近的樣品區(qū)域才會激發(fā),，從而實現(xiàn)三維成像和高分辨率,。

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物,，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子,。雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢？它能做普通光學顯微鏡做不到的事情嗎,？原來雙光子顯微鏡可以準確穿透厚標本進行定點和***觀察,！因為電磁波的波長越短，粒子越強,，散射的影響越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力,，同時降低了對細胞的毒性,。此外，由于雙光子激發(fā)效應(yīng)只能發(fā)生在物鏡的焦點處,，因此掃描精度極高,，還可以提高激發(fā)光效率，減少掃描點以外的熒光物質(zhì)的消耗,。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?美國ultima雙光子顯微鏡用途

雙光子顯微鏡角膜成像,。國外ultima雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理,。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫,，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞,，使掃描能更好地進行,。國外ultima雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)