針對(duì)雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn)，從理論上分析雙光子成像特點(diǎn),，并搭建一套時(shí)間,、空間分辨率高，能實(shí)時(shí),、動(dòng)態(tài)、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng),。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶（1）能對(duì)不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測;（2）用特定染料對(duì)樣品標(biāo)記以后,，能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實(shí)驗(yàn)的研究，改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下,，簡化整個(gè)系統(tǒng),，使得實(shí)驗(yàn)操作方便、安全,。單光子激發(fā)熒光的過程,，就是熒光分子吸收一個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子,，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí),。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢。而在顯微成像中,，雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn),，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測的重要工具。多光子激光掃描顯微鏡是建立在激光掃描顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)方法,，三維觀察上提供更的光學(xué)切片能力,。美國離體多光子顯微鏡峰值功率密度

    基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品,。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡,。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長比共焦長,，能量較低,，但穿透能力較強(qiáng)；2)雙光子顯微鏡沒有小孔,，提高了檢測效率,；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么,，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢呢,？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長較長的激發(fā)光子，光子的能量較低,，因此電子需要吸收兩個(gè)這樣的激發(fā)光子才能達(dá)到激發(fā)態(tài),，從而釋放出一個(gè)熒光光子。因此,，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的平方成正比,。因?yàn)榻裹c(diǎn)處的光強(qiáng)較大，只能在焦點(diǎn)處激發(fā)熒光,。波長越長,，穿透力越強(qiáng)，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡,。由于兩個(gè)光子只在焦點(diǎn)激發(fā)熒光,，不需要小孔，而是將所有的熒光都收集起來,，提高了檢測效率,。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡，利用三個(gè)激發(fā)光子可以實(shí)現(xiàn)更深的成像深度,。由于使用了更長的激發(fā)波長,，穿透能力更強(qiáng),，成像深度更大,。此外，由于較強(qiáng)的非線性效應(yīng),，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的立方成正比,，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。 Ultima 2P Plus多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)點(diǎn)掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質(zhì)量的圖像,，但這個(gè)過程極其緩慢,，因?yàn)閳D像是一次形成一個(gè)點(diǎn)。

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展,，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本,，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為,，2020年,，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向,。目前世界市場對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長,，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

    與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能,，極大地促進(jìn)了研究人員對(duì)整個(gè)大腦深部神經(jīng)的認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像,、大數(shù)量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像三個(gè)方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù)。為了將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對(duì)大腦皮層深處的神經(jīng)元進(jìn)行成像,，這就要求MPM具備深度成像的能力。激發(fā)光和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收,，這是限制MPM成像深度的主要因素,。雖然增加激光強(qiáng)度可以解決散射問題，但會(huì)帶來其他問題,，如燒焦樣品,、散焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光,。另外,，對(duì)于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào),。 多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中,。還有其他類型的圖像對(duì)比提供有關(guān)樣本的有價(jià)值信息。

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出,，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢,。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實(shí)現(xiàn)對(duì)分子代謝的成像,，空間分辨率∶1-2mm,，時(shí)間分辨率;分鐘量級(jí)。與PET比較,，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù),，請參見表1-1），且具有更高的時(shí)間分辨率（秒級(jí)）,，空間分辨率可達(dá)到微米,。因此，二者相比,，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET,，但在測量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對(duì)于小動(dòng)物（如小白鼠）研究來說,，光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物整體成像和在體基因表達(dá)成像,。例如,，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像,。多光子激光掃描顯微鏡采用波長較長的紅外激光,能量脈沖式激發(fā),紅外光比可見光在生物組織中的穿透力更強(qiáng),。靈長類多光子顯微鏡Ultima Investigator

目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。美國離體多光子顯微鏡峰值功率密度

多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足,。只能對(duì)熒光成像,。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán)，如色素,，樣品可能受到熱損傷,。分辨率略有降低，雖然可以通過同時(shí)利用共焦的小孔得到改善,，但是信號(hào)會(huì)有損耗,。受昂貴的超快激光器限制，多光子掃描顯微鏡的成本較高,。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例,。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、動(dòng)物腦皮層的成像,、胚胎發(fā)育過程的長時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測,、多光子激發(fā)光解籠、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué),、多光子激發(fā)自發(fā)熒光,、其它應(yīng)用。美國離體多光子顯微鏡峰值功率密度