系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍(lán)寶石激光器出射后,，由一個(gè)光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段,，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200fs,重復(fù)頻率80MHz，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧,。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中,，形成用于熒光激發(fā)的多焦點(diǎn)光束。多焦點(diǎn)光束通過一個(gè)硅油浸潤的物鏡成像到樣品上,，激發(fā)熒光信號(hào),。熒光信號(hào)由同一個(gè)物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應(yīng),，隔離來自焦平面外的雜散光,。雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物。國外熒光激光雙光子顯微鏡作用

目前,，世界各國的腦科學(xué)研究如火如荼,，中國的腦計(jì)劃也即將啟動(dòng)。其中,，關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究成為重點(diǎn)研究方向,，而如何打破尺度壁壘，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的信息處理和個(gè)體行為信息,，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn),。2021年1月6日，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系,、工學(xué)院以及中國人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì),，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報(bào)道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,，其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時(shí)具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運(yùn)動(dòng)行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像,，并且實(shí)現(xiàn)了針對(duì)同一批神經(jīng)元長達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄,。國外熒光激光雙光子顯微鏡作用于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá)，因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會(huì)激發(fā),，從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率,。

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長波長的光子,，然后發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子,，其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí),，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。

雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù),，可以在保持細(xì)胞活性的情況下,，對(duì)深層組織進(jìn)行高分辨率成像。它主要用于生物學(xué),、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究,。雙光子顯微鏡的重心技術(shù)是基于雙光子激發(fā)的熒光成像。當(dāng)激光通過樣品時(shí),，它會(huì)吸收特定波長的光子,，然后發(fā)出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個(gè)連續(xù)的光子同時(shí)激發(fā)樣品,，這樣可以在保持樣品完整性的同時(shí),，獲得高質(zhì)量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性,，它可以獲得比傳統(tǒng)顯微鏡更高的分辨率,。2.深層成像：由于激光的穿透深度限制,，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡無法對(duì)深層組織進(jìn)行成像。而雙光子顯微鏡可以解決這個(gè)問題,，因?yàn)樗梢约ぐl(fā)樣品的深層熒光,。3.活細(xì)胞成像：雙光子顯微鏡可以在保持細(xì)胞活性的情況下進(jìn)行成像，這對(duì)于研究細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)過程非常有用,。4.多模式成像：雙光子顯微鏡可以結(jié)合多種技術(shù),，如光譜成像、鈣離子成像和神經(jīng)活動(dòng)成像等,，以提供更豐富的生物樣品信息,。總之,，雙光子顯微鏡是一種強(qiáng)大的研究工具,，可以對(duì)深層組織和活細(xì)胞進(jìn)行無損成像。這使得它在生物學(xué),、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究中具有廣泛的應(yīng)用,。雙光子顯微鏡中,，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè),，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上,。即便如此，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多,，首先是便宜，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了,。其次是靈活，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配,，改動(dòng)也靈活,。好處就是可以鍛煉隊(duì)伍，一趟走下來可以把新手帶出來,，后期維護(hù)也更加自由,。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心,，特別是第1次搭的時(shí)候,，開始要想方案，后來要解決各種實(shí)際問題。其次是花時(shí)間,，加上買配件的時(shí)間,，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol,，大多是老外寫的，中文的較少,。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候，容易走彎路,，多花錢,，也多花時(shí)間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長,。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn),，貼出來分享,，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室，雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。美國布魯克雙光子顯微鏡分辨率是多少

由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長時(shí)間的研究,。國外熒光激光雙光子顯微鏡作用

雙光子技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力,，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術(shù),，進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu),、生化成分、微環(huán)境,、組織形態(tài),、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細(xì)胞學(xué),、分子生物學(xué),、組織病理學(xué)、診斷和特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系,，共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,，篩選鑒定、皮膚病,、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù),，建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫,，定義出針對(duì)不同疾病的多光子臨床檢測(cè)設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。討論環(huán)節(jié),，來自病理科,、呼吸中心、心臟科,、神經(jīng)科,、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結(jié)合各自的工作領(lǐng)域與王愛民副教授展開了熱烈的討論，其中毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任計(jì)劃再次邀請(qǐng)王愛民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流,。國外熒光激光雙光子顯微鏡作用