對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像,；對(duì)于相鄰區(qū)域,，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_,，這可以通過(guò)事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲,，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多,，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力,；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高,；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷,。多光子激光掃描顯微鏡采用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅外激光,能量脈沖式激發(fā),紅外光比可見(jiàn)光在生物組織中的穿透力更強(qiáng),。高速高分辨率多光子顯微鏡配置

多光子激發(fā)在紫外成像的優(yōu)勢(shì)在可見(jiàn)光脈沖中能得到紫外衍射的顯微觀察像。即使不使用紫外域光源,、光學(xué)元件用可見(jiàn)光源,、光學(xué)元件就能得到紫外光激勵(lì)的高空間分辨率圖像。多光子在生物成像中的優(yōu)勢(shì)在生物顯微鏡觀察方面,，較早考慮的是不損壞生物本身的活性狀態(tài),，維持水分,、離子濃度、氧和養(yǎng)分的流通,。在光觀察場(chǎng)合,，無(wú)論是熱還是光子能量方面都必須停留在細(xì)胞不受損傷的照射量、光能量?jī)?nèi),。多光子顯微鏡則能夠滿(mǎn)足此,，而且還具有很多優(yōu)點(diǎn)。如三維分辨率,、深度侵入,、在散射效率、背景光,、信噪比,、控制等方面，均有以往激光顯微鏡不具備,，或具有無(wú)法比擬的超越特性,。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡長(zhǎng)時(shí)間觀察多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿(mǎn)了貢獻(xiàn)、開(kāi)發(fā),、進(jìn)步和數(shù)個(gè)世紀(jì)以來(lái)多個(gè)來(lái)源和地點(diǎn)的改進(jìn),。

針對(duì)雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn)，從理論上分析雙光子成像特點(diǎn),，并搭建一套時(shí)間,、空間分辨率高，能實(shí)時(shí),、動(dòng)態(tài),、多參數(shù)測(cè)量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶（1）能對(duì)不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測(cè);（2）用特定染料對(duì)樣品標(biāo)記以后,，能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過(guò)實(shí)驗(yàn)的研究,，改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下，簡(jiǎn)化整個(gè)系統(tǒng),，使得實(shí)驗(yàn)操作方便,、安全。單光子激發(fā)熒光的過(guò)程,，就是熒光分子吸收一個(gè)光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周?chē)姆肿樱约夯氐奖容^低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢(shì),。而在顯微成像中,，雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測(cè)的重要工具,。

在多光子顯微鏡（也稱(chēng)為非線(xiàn)性或雙光子顯微鏡）中,，以?xún)杀墩＜ぐl(fā)波長(zhǎng)照射樣品。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)是有利的,，因?yàn)樗鼈兛梢愿畹卮┩笜悠愤M(jìn)行3D成像,，并且因?yàn)樗鼈儾粫?huì)損壞樣品，從而延長(zhǎng)樣品壽命,。為了實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā),，照明光束在空間上聚焦（使用光學(xué)器件），同時(shí)使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個(gè)（或更多）光子同時(shí)到達(dá)同一位置（即熒光團(tuán)分子）的概率,。多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生(SHG),、三次諧波產(chǎn)生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術(shù),。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要,，并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低GDD特性,。多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中。還有其他類(lèi)型的圖像對(duì)比提供有關(guān)樣本的有價(jià)值信息,。

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度,。近年來(lái)，通過(guò)使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描,；但是,，遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度，ETL會(huì)引入球面像差和更高階像差,，從而無(wú)法進(jìn)行高分辨率成像,。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計(jì),，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無(wú)球差的軸向掃描,。該設(shè)計(jì)有兩種實(shí)現(xiàn)方式，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描,。具體裝置如圖3a所示，由兩個(gè)垂直臂組成,，每個(gè)臂中都有一個(gè)4F望遠(yuǎn)鏡和一個(gè)物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個(gè)檢流掃描鏡（GSM）和一個(gè)空氣物鏡（OBJ1）,，另一個(gè)臂（稱(chēng)為照明臂）由一個(gè)水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個(gè)臂對(duì)齊,，以使GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中，GSM對(duì)其進(jìn)行掃描,，進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)進(jìn)行橫向掃描,。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞層面觀察，多光子顯微鏡技術(shù)助力醫(yī)學(xué)突破,。美國(guó)進(jìn)口多光子顯微鏡峰值功率密度

世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本,，德國(guó)是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司。高速高分辨率多光子顯微鏡配置

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能,，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年,，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像,、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1],。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來(lái),，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力,。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,，雖然可以通過(guò)增加激光強(qiáng)度來(lái)解決散射問(wèn)題，但這會(huì)帶來(lái)其他問(wèn)題,，例如燒壞樣品,、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光,。高速高分辨率多光子顯微鏡配置