通過對顯微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴展至420×420平方微米,，顯微物鏡的工作距離擴展至1mm,，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊,，實現(xiàn)深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實時成像,。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成，在不同深度成像時保持放大率恒定,。其中,，變焦模塊重1.8克，科研人員可以根據(jù)實驗要求自由拆卸,。此外,，新型微型成像探頭可以瞬間插拔，極大簡化了實驗操作,，避免了長時間實驗對動物的干擾,。反復(fù)裝卸探針追蹤同批神經(jīng)元時,，視場旋轉(zhuǎn)角度小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米,。雙光子顯微鏡知多少,。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率

微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的方式，可用于在動物覓食,、哺乳,、跳臺、打斗,、嬉戲,、睡眠等自然行為條件下，長時程觀察神經(jīng)突觸,、神經(jīng)元,、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠程連接的腦區(qū)等多尺度,、多層次動態(tài)變化,。該成果在2016年底美國神經(jīng)科學(xué)年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議上報告后,，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家的高度贊譽,。冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議、美國明顯神經(jīng)科學(xué)家加州大學(xué)洛杉磯分校的AlcinoJSilva教授在評述中寫道,，“從任何一個標(biāo)準(zhǔn)來看,，這款顯微鏡都了一項重大技術(shù)發(fā)明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的方式,。它所開啟的大門,，甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像。系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)正在進入一個新的時代,，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物學(xué)事件進行成像觀測,。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率于雙光子激發(fā)需要兩個光子同時到達，因此只有在焦點附近的樣品區(qū)域才會激發(fā),，從而實現(xiàn)三維成像和高分辨率,。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化,。結(jié)合其特點,，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發(fā)激光進入更深的層次,，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個方面入手,。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細，集中能量,，讓激光穿透得更深,。對于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素,。為了解決這個問題,，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本,，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解,。另一種方法是通過電泳電解脂類,，從而提高標(biāo)本的“透明度”,。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低,。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達到80至100兆赫茲,。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中,，它能對樣品進行三維觀察。

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗,。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當(dāng)中,；國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡分辨率