多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度，和較高的對比度在生物成像中有著重要的意義,，但是它通常需要較高的功率,。結合時間上展開的超短脈沖可以實現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但是其本身所利用的近紅外波段的光會導致分辨率較低,。清華大學陳宏偉教授和北京大學席鵬研究員合作研究,，結合了結構光成像和上轉化粒子，開發(fā)了一種基于多光子上轉化材料和時間編碼結構光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM),。它可以實現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度,，并突破了衍射極限，實現(xiàn)了超分辨成像,。相較于普通的熒光顯微鏡,，該顯微鏡提升了，并且只需要較低的激發(fā)功率,。這種超快,、低功率、多光子的超分辨技術,，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長遠的應用前景,。 多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率。熒光多光子顯微鏡原理

    基于多光子顯微鏡的神經成像技術原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像,，因此可用于拍攝不透明的厚樣品,。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結構與共焦類似,，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長比共焦長,，能量較低，但穿透能力較強,；2)雙光子顯微鏡沒有小孔,，提高了檢測效率,；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么,，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢呢,？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長較長的激發(fā)光子,，光子的能量較低,，因此電子需要吸收兩個這樣的激發(fā)光子才能達到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個熒光光子,。因此,，熒光信號的強度與光強的平方成正比。因為焦點處的光強較大,，只能在焦點處激發(fā)熒光,。波長越長，穿透力越強,，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡,。由于兩個光子只在焦點激發(fā)熒光，不需要小孔,，而是將所有的熒光都收集起來,，提高了檢測效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡,，利用三個激發(fā)光子可以實現(xiàn)更深的成像深度,。由于使用了更長的激發(fā)波長，穿透能力更強,，成像深度更大,。此外，由于較強的非線性效應,，熒光信號的強度與光強的立方成正比,，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。 Ultima Investigator多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析未來國產多光子激光掃描顯微鏡替代空間大,。

我們要指出的是,，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產生的機理上來區(qū)分的,。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結構，其目的是為了,，通過共焦結構,，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同,，實現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像,。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結構）其空間分辨率也可以達到單光子共焦熒光顯微鏡的水平,。這樣就可以簡化整個系統(tǒng)，相對來說,，就提高了激發(fā)光源的利用率,，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一,。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應和共焦結構,，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的,。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡（MPM）具有光學切片和深層成像等功能，這兩個優(yōu)勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經的了解與認識,。2019年,，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經元成像、大量神經元成像,、高速神經元成像這三個方面論述了相關的MPM技術[1],。想要將神經元活動與復雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮質深層的神經元進行成像,，這就要求MPM具有深層成像的能力,。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題,，但這會帶來其他問題,，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光,。多光子顯微鏡將生物打印結構準確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內制造復雜結構,。

2020年,，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）,。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,，會聚角為Δθ。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中,，其間距為S,，偏角為α。經過反射鏡多次反射后,，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α）,，脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點,，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠,，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。多光子顯微鏡銷售渠道分析及建議,。美國共聚焦多光子顯微鏡實驗

點掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質量的圖像，但這個過程極其緩慢,，因為圖像是一次形成一個點,。熒光多光子顯微鏡原理

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產業(yè)主要布局在德國和日本,，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為,，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年,，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額,，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長,，中國市場這方面的需求增長更快,，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿Α晒舛喙庾语@微鏡原理