在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項(xiàng)《超高時(shí)空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下,，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所,、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動態(tài)成像中心,、生命科學(xué)學(xué)院,、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像,。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3),，并已申請多項(xiàng)。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔,，提高了熒光檢測效率,。國外bruker雙光子顯微鏡光毒性

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長波長的光子,，然后發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子,，其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時(shí),，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí),，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響,。進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡供應(yīng)商雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦）,，這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高,。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊,?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動等,。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種,，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說,，每個(gè)時(shí)刻,，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測。通過點(diǎn)掃描的方式,，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是,，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn),，出才會激發(fā)出熒光,。也就是說，雙光子顯微鏡中,，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測,，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例,。ultima雙光子顯微鏡多少錢

雙光子顯微鏡大量運(yùn)營在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中,；國外bruker雙光子顯微鏡光毒性

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化,。結(jié)合其特點(diǎn),，大致可以分為兩個(gè)方面:深入和主動改進(jìn)。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次,，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個(gè)方面入手,。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細(xì),，集中能量,，讓激光穿透得更深。對于樣品,，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素,。為了解決這個(gè)問題，我們需要將樣本透明化,。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本,，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類,，從而提高標(biāo)本的“透明度”,。國外bruker雙光子顯微鏡光毒性