細胞在受到外界刺激時,，隨著刺激時間的增長,，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強,，反而會減弱，直至恢復到未加刺激物時的水平,。對于細胞受精過程中 Ca2+熒光信號的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn),，配了在粘著過程中,，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時,，Ca2+熒光信號強度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象,，對研究受精發(fā)育的早期信號及 Ca2+在卵細胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細胞分裂,、胞吐作用等，Ca2+熒光信號強度也會發(fā)生很的變化,。世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本,，德國是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司。模塊化多光子顯微鏡技術(shù)

2020年,，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置,，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,，會聚角為Δθ,。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S,，偏角為α,。經(jīng)過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α）,，脈沖間以2S/c的時間延遲（c,，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點,，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠,，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。嚙齒類多光子顯微鏡焦點激發(fā)利用多光子顯微鏡的光遺傳學操作能力,，我們可以對某類神經(jīng)元的ji活和失活進行高精度的操作。

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式,，使用振鏡進行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示,。在LSU模塊中,，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動以進行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡,。

多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足,。只能對熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團,，如色素,，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低,，雖然可以通過同時利用共焦的小孔得到改善,，但是信號會有損耗。受昂貴的超快激光器限制,，多光子掃描顯微鏡的成本較高,。多光子激發(fā)顯微鏡應用舉例。動物和腦片神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)與功能,、動物腦皮層的成像,、胚胎發(fā)育過程的長時間動態(tài)觀測、多光子激發(fā)光解籠,、細胞內(nèi)微區(qū)鈣動力學,、多光子激發(fā)自發(fā)熒光、其它應用,。雙光子共聚焦顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡具有更亮的橫向分辨率和縱向分辨率,。

從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場,。2020年,，全球多光子激光掃描正置顯微鏡市場達到87.30百萬美元,，預計到2027年該部分市場將達到154.02百萬美元，年復合增長率（2021-2027）為8.48%,。中國多光子激光掃描正置顯微鏡市場達到13.32百萬美元,，預計到2027年該部分市場將達到25.21百萬美元，年復合增長率（2021-2027）為9.58%,。從產(chǎn)品市場應用情況來看,，研究機構(gòu)為主要應用領域，2020年約占全球市場46.28%,。2020年,，全球多光子激光掃描顯微鏡研究機構(gòu)應用消費量為174臺，預計2027年達到349臺,，2021-2027年復合增長率（CAGR）為9.72%。點掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質(zhì)量的圖像,，但這個過程極其緩慢,，因為圖像是一次形成一個點。布魯克多光子顯微鏡成像精度

多光子顯微鏡之類的先進光學技術(shù)能夠在活生物體的大腦表面下更深地成像,。模塊化多光子顯微鏡技術(shù)

某種物質(zhì)能產(chǎn)生熒光,，首要條件是分子必須具有吸收的結(jié)構(gòu)，即生色團（分子中具有吸收特征頻率的光能的基團）,。其次,，該物質(zhì)必須具有一定的量子產(chǎn)率和適宣的環(huán)境。我們把分子中發(fā)射熒光的基團稱為熒光團,。熒光團一定是生色團,，但生色團不一定是熒光團。因為,，如果生色團的量子產(chǎn)率等于零,，就不能發(fā)射出熒光，處于激發(fā)態(tài)的分子,，可以由許多方式（如熱,，碰撞）把能量釋放出來，發(fā)射熒光只是其中的一種方式,。此外,，一種物質(zhì)吸收光的能力及量子產(chǎn)率又與物質(zhì)所處的環(huán)境密切相關。模塊化多光子顯微鏡技術(shù)