多光子激發(fā)在紫外成像的優(yōu)勢(shì)在可見光脈沖中能得到紫外衍射的顯微觀察像。即使不使用紫外域光源,、光學(xué)元件用可見光源,、光學(xué)元件就能得到紫外光激勵(lì)的高空間分辨率圖像。多光子在生物成像中的優(yōu)勢(shì)在生物顯微鏡觀察方面，較早考慮的是不損壞生物本身的活性狀態(tài),，維持水分,、離子濃度、氧和養(yǎng)分的流通,。在光觀察場(chǎng)合,，無論是熱還是光子能量方面都必須停留在細(xì)胞不受損傷的照射量、光能量?jī)?nèi),。多光子顯微鏡則能夠滿足此,，而且還具有很多優(yōu)點(diǎn)。如三維分辨率,、深度侵入,、在散射效率、背景光,、信噪比,、控制等方面，均有以往激光顯微鏡不具備,，或具有無法比擬的超越特性,。雙光子顯微鏡采用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)。全自動(dòng)多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2],。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度,。近年來,，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描；但是,，遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度,，ETL會(huì)引入球面像差和更高階像差，從而無法進(jìn)行高分辨率成像,。為了克服這些局限性,，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計(jì)，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描,。該設(shè)計(jì)有兩種實(shí)現(xiàn)方式,，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描，另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描,。具體裝置如圖3a所示，由兩個(gè)垂直臂組成,，每個(gè)臂中都有一個(gè)4F望遠(yuǎn)鏡和一個(gè)物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個(gè)檢流掃描鏡（GSM）和一個(gè)空氣物鏡（OBJ1），另一個(gè)臂（稱為照明臂）由一個(gè)水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個(gè)臂對(duì)齊,，以使GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中，GSM對(duì)其進(jìn)行掃描,，進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)進(jìn)行橫向掃描,。美國(guó)嚙齒類多光子顯微鏡數(shù)據(jù)采集多光子顯微鏡中，極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點(diǎn)上,，激發(fā)熒光團(tuán)產(chǎn)生圖像,。

隨著生物分子光學(xué)標(biāo)記技術(shù)的不斷進(jìn)步，光學(xué)技術(shù)在揭示生命活動(dòng)基本規(guī)律的研究中正發(fā)揮越來越重要的作用,，也為醫(yī)學(xué)診療提供了更多,、更有效的手段。生物醫(yī)學(xué)光學(xué)（BiomedicalOptics）是近年來受到國(guó)際光學(xué)界和生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的研究熱點(diǎn),，在生物活檢,、光動(dòng)力、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能檢測(cè),、基因表達(dá)規(guī)律的在體研究等問題上取得了一系列研究成果,，目前正在從宏觀到微觀上對(duì)大腦活動(dòng)與功能進(jìn)行多層面的研究。細(xì)胞重大生命活動(dòng)（包括細(xì)胞增殖,、分化,、凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）的發(fā)生和調(diào)節(jié)是通過生物大分子間（如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸等）相互作用來實(shí)現(xiàn)的,。蛋白質(zhì)作為基因調(diào)控的產(chǎn)物,，與細(xì)胞和機(jī)體生理過程代謝直接相關(guān)，深入研究基因表達(dá)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用不僅能揭示生命活動(dòng)的基本規(guī)律,，同時(shí)也能深入了解疾病發(fā)生的分子機(jī)理,，進(jìn)而為尋找更有效的藥物分子、提高藥物篩選和藥物設(shè)計(jì)的效率提供新的方法和思路,。

多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足,。只能對(duì)熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán),，如色素,，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低,，雖然可以通過同時(shí)利用共焦的小孔得到改善,，但是信號(hào)會(huì)有損耗。受昂貴的超快激光器限制,，多光子掃描顯微鏡的成本較高,。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例,。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、動(dòng)物腦皮層的成像,、胚胎發(fā)育過程的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測(cè),、多光子激發(fā)光解籠、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué),、多光子激發(fā)自發(fā)熒光,、其它應(yīng)用。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。

    多光子顯微優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小,，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收*局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器，這樣就提高了對(duì)熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高,；☆圖像對(duì)比度高：由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng)，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,，降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究,；☆避免組織自發(fā)熒光的干擾,，獲得較強(qiáng)的樣品熒光：生物組織中的自發(fā)熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)一般在350~560nm范圍內(nèi)，采用近紅外或紅外波段的激光作為光源,，能**降低生物組織對(duì)激發(fā)光吸收,。 OCT可以用于損傷修復(fù)監(jiān)測(cè)。Yeh等用OCT,、多光子顯微鏡,。美國(guó)離體多光子顯微鏡成像精度

多光子顯微鏡作為神經(jīng)科學(xué)重要的研究工具,，近年來發(fā)展快速，品牌也眾多,。全自動(dòng)多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

    基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品,。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡,。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng)比共焦長(zhǎng),，能量較低,，但穿透能力較強(qiáng)；2)雙光子顯微鏡沒有小孔,，提高了檢測(cè)效率,；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么,，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢(shì)呢,？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激發(fā)光子,，光子的能量較低,，因此電子需要吸收兩個(gè)這樣的激發(fā)光子才能達(dá)到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個(gè)熒光光子,。因此,，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的平方成正比。因?yàn)榻裹c(diǎn)處的光強(qiáng)較大,，只能在焦點(diǎn)處激發(fā)熒光,。波長(zhǎng)越長(zhǎng)，穿透力越強(qiáng),，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡,。由于兩個(gè)光子只在焦點(diǎn)激發(fā)熒光，不需要小孔,，而是將所有的熒光都收集起來,，提高了檢測(cè)效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡,，利用三個(gè)激發(fā)光子可以實(shí)現(xiàn)更深的成像深度,。由于使用了更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)，穿透能力更強(qiáng),，成像深度更大,。此外，由于較強(qiáng)的非線性效應(yīng),，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的立方成正比,，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲,。 全自動(dòng)多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析