多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度,，和較高的對(duì)比度在生物成像中有著重要的意義，但是它通常需要較高的功率。結(jié)合時(shí)間上展開的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度,，但是其本身所利用的近紅外波段的光會(huì)導(dǎo)致分辨率較低。清華大學(xué)陳宏偉教授和北京大學(xué)席鵬研究員合作研究,，結(jié)合了結(jié)構(gòu)光成像和上轉(zhuǎn)化粒子,，開發(fā)了一種基于多光子上轉(zhuǎn)化材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)。它可以實(shí)現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度,，并突破了衍射極限,，實(shí)現(xiàn)了超分辨成像。相較于普通的熒光顯微鏡,，該顯微鏡提升了,，并且只需要較低的激發(fā)功率。這種超快,、低功率,、多光子的超分辨技術(shù)，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長遠(yuǎn)的應(yīng)用前景,。 多光子顯微鏡中,，極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點(diǎn)上，激發(fā)熒光團(tuán)產(chǎn)生圖像,。美國清醒動(dòng)物多光子顯微鏡研究

2020年,，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）,。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,，會(huì)聚角為Δθ。光束進(jìn)入到一對(duì)幾乎平行的高反射鏡中,，其間距為S,，偏角為α。經(jīng)過反射鏡多次反射后,，激光脈沖被分成多個(gè)傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α）,，脈沖間以2S/c的時(shí)間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。全自動(dòng)多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。

多光子激發(fā)的特點(diǎn),。激發(fā)波長∶兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)激發(fā),，激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）。多光子激發(fā)∶依賴于多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)的時(shí)間,。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16 seconds）,，且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點(diǎn)處,，能滿足多個(gè)光子同時(shí)達(dá)到產(chǎn)生多光子吸收,。熒光強(qiáng)度正比于（激光強(qiáng)度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器,，皮秒脈沖不能實(shí)現(xiàn)三光子激發(fā),。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率,。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū),，對(duì)細(xì)胞毒性和光漂白更小。

對(duì)于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào),。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描,，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng),；需要更高的脈沖能量,，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接,。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng),，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力,。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看,，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場。

當(dāng)激光光束焦點(diǎn)的位置在鏡面上,，此時(shí)被反射的激光在無限空間中成為準(zhǔn)直光束,，并在OBJ2的焦平面上形成了一個(gè)激光光斑。同理,，如果橫向掃描光束,，則會(huì)形成遠(yuǎn)離傾斜鏡鏡面的焦點(diǎn)，這又導(dǎo)致返回的光束會(huì)聚或發(fā)散,，進(jìn)而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點(diǎn),，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描。對(duì)于較小的傾斜角,，聚焦沒有球差,。該組在實(shí)驗(yàn)中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí),，從而可以在三個(gè)維度上量化快速的囊泡動(dòng)力學(xué),。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進(jìn)行共振遠(yuǎn)程聚焦，該技術(shù)可對(duì)大腦組織和斑馬魚心臟動(dòng)力學(xué)進(jìn)行快速成像,，并具有衍射極限的分辨率,。 多光子顯微鏡適用于動(dòng)物大腦皮層深層（400微米）細(xì)胞的形態(tài)、生理學(xué)研究,。靈長類多光子顯微鏡層析成像

使用雙光子顯微鏡觀察標(biāo)本的時(shí)候,，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。美國清醒動(dòng)物多光子顯微鏡研究

我們要指出的是,，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光,，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu),，其目的是為了,，通過共焦結(jié)構(gòu)，提高整個(gè)熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同,，實(shí)現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像,。往往一個(gè)普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個(gè)系統(tǒng),，相對(duì)來說,，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測效率,，這個(gè)也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一,。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu)，分辨率則會(huì)更高,，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的,。美國清醒動(dòng)物多光子顯微鏡研究