Ca2+是重要的第二信使,，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有重要的作用,，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進(jìn)行觀測,，可以從某些方面對有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析，具有重要的意義,。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的 Ca2*的時(shí)間和空間的熒光圖像的變化，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化,。通過對單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的 Ca2+梯差即所謂的空間 Ca2梯差。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡,。激光掃描多光子顯微鏡多光子激發(fā)

要想實(shí)現(xiàn)離散的軸向重新聚焦,，需要在OBJ1的焦平面中放置一個(gè)階梯鏡（圖3b）。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時(shí),，被反射的激光將在無窮大的空間中成為準(zhǔn)直光束,，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑。并且返回的激光束會被GSM消除橫向掃描,，即OBJ2形成的焦點(diǎn)不會進(jìn)行橫向掃描,，實(shí)現(xiàn)軸向掃描。如果激光點(diǎn)被掃描到與焦平面不一致的階梯,，則會形成遠(yuǎn)離鏡面的激光焦點(diǎn),，返回的激光束會在無窮大的空間中會聚或發(fā)散，進(jìn)而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點(diǎn)也在軸向重新聚焦,，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)離散的軸向掃描,。對于已精確匹配兩個(gè)物鏡光瞳的光學(xué)裝置，不會引入像差,。為了進(jìn)行連續(xù)的軸向重新聚焦,，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡，同時(shí)入射的激光焦點(diǎn)也需要被傾斜,，使得其以垂直于鏡面的方向入射,，通過相對入射激光束稍微平移OBJ1即可實(shí)現(xiàn)這種傾斜。美國全自動(dòng)多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位1990年A.Mayer在Science上刊文展示了雙光子激光掃描熒光顯微鏡,。

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場（FOV）的神經(jīng)組織：使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí),，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間,。隨機(jī)訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上,，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描,，利用1對AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描,。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感,，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前,，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描,，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用,。

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā)，光散射?。ㄐ×Ｗ拥纳⑸渑c波長的四次方的成反比）,。不需要***，能更多收集來自成像截面的散射光子,。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點(diǎn)區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減,，不易對深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點(diǎn)。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質(zhì)成像,。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測定的信噪比更高,。觀察活細(xì)胞∶離子測量（i.e.Ca2+）,，GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,，能對細(xì)胞長時(shí)間觀察,。多光子顯微鏡的大多數(shù)補(bǔ)償器都采用棱鏡。

    雙光子顯微鏡工作原理是將超快的紅外激光脈沖傳輸?shù)綐悠分?，在樣品中與組織或熒光標(biāo)記相互作用,，這些組織或熒光標(biāo)記發(fā)出用于創(chuàng)建圖像的信號。雙光子顯微鏡被多用于生物學(xué)研究,，因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生高分辨率的3-D圖像,，深度達(dá)1毫米。然而,，這些優(yōu)點(diǎn)帶來了有限的成像速度,，因?yàn)槲⒐鈼l件需要逐點(diǎn)圖像采集和重建的點(diǎn)檢測器。為了加快成像速度,，科學(xué)家之前開發(fā)了一種多焦點(diǎn)激光照明方法,，該方法使用數(shù)字微鏡設(shè)備(DMD)，這是一種通常用于投影儀的低成本光掃描儀,。此前人們認(rèn)為這些DMD不能與超快激光一起工作,。然而現(xiàn)在解決了這個(gè)問題，這使得DMD在超快激光應(yīng)用中得以應(yīng)用,，這些應(yīng)用包括光束整形、脈沖整形,、快速掃描和雙光子成像,。DMD在樣品內(nèi)隨機(jī)選擇的位置上產(chǎn)生5到30點(diǎn)聚焦激光,。 雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。美國離體多光子顯微鏡代理

多光子顯微鏡銷售/營銷策略建議,。激光掃描多光子顯微鏡多光子激發(fā)

以往我們認(rèn)識的光電效應(yīng)是單光子光電效應(yīng),，即一個(gè)電子在極短時(shí)間內(nèi)能吸收到一個(gè)光子而從金屬表面逸出。強(qiáng)激光的出現(xiàn)豐富了人們對于光電效應(yīng)的認(rèn)識,，用強(qiáng)激光照射金屬,，由于其光子密度極大，一個(gè)電子在短時(shí)間吸收多個(gè)光子成為可能,，從而形成多光子電效應(yīng),，這已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為什么一般討論的光電效應(yīng)都是指單光子光電效應(yīng)呢,？這是因?yàn)?，在使用普通光源的情況下，電子吸收兩個(gè)以上光子能量的概率是非常非常小的,，幾乎為零,。事實(shí)上，愛因斯坦本人就考慮過在強(qiáng)光下發(fā)生光電效應(yīng)的可能性問題,。對此,，他有如下的論述：光電效應(yīng)中的一個(gè)電子吸收兩個(gè)光子的幾率不會大于下雨天兩個(gè)雨滴同事打在一個(gè)螞蟻上的幾率。因此,，多光子光電效應(yīng)在實(shí)驗(yàn)上的研究成為可能,，是二十世紀(jì)六十年代激光乃至強(qiáng)激光出現(xiàn)以后的事情。有了激光,，對于雙光子光電效應(yīng),，在實(shí)驗(yàn)上和理論上均取得了許多成果。利用強(qiáng)激光,，人們不僅觀察到雙光子和三光子的光電效應(yīng),，甚至觀察到金靶材吸收幾十個(gè)等效光子實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。激光掃描多光子顯微鏡多光子激發(fā)