因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測效率。多光子激光掃描顯微鏡已經(jīng)成為了一個活躍且多產(chǎn)的領域,。美國全自動多光子顯微鏡應用

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展,，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為,，而日本以尼康和奧林巴斯公司為,，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額,，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向,。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快,，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。美國全自動多光子顯微鏡應用多光子顯微鏡技術的優(yōu)勢如何？又有哪些應用,？

根據(jù)阿貝成像原理,，許多光學成像系統(tǒng)是一個低通濾波器，物平面包含從低頻到高頻的信息,，透鏡口徑會限制高頻信息通過,，只允許一定的低頻通過，因此丟失了高頻信息會使成像所得圖像的細節(jié)變模糊,，降低分辨率,。對于三維成像來說，寬場照明時得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息,，同時還包含焦平面外的樣品信息,。由于受到焦平面外的信息干擾,，常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像。三維結構光照明顯微鏡能夠提高分辨率,、獲得層析圖像,，是因為利用特定結構的照明光能引入樣品的高頻信息，當結構光的空間頻率足夠高時,，只有靠近焦面的部分才能被結構光調制,，超出這一區(qū)域，逐漸轉變?yōu)榫鶆蛘彰?，也就是只有焦面附近的有限區(qū)域具有相對完整的頻譜信息,，離焦后，高頻信息迅速衰減,，所以使用高頻結構光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來獲得層析圖像,。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像，重建樣品的三維結構,。

ＳｔｅｒｎａｎｄＪｅａｎＭａｒｘ在評論中說：祖家能夠在更為精細的層次研究樹突的功能,，這在以前是完全不可能的。新的技術（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計算和神經(jīng)信號處理中的作用有了更好的理解,。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性,，及其獨特的電、及其獨特的電化學特征使神經(jīng)元完成了一系列的專門任務,。雙光子與共聚焦在發(fā)育生物學中的應用雙光子∶ 每2.5分鐘掃描一次,，觀察24小時，發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次,，觀察8小時后細胞分裂停止,，不能發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發(fā)時的細胞存活率為多光子系統(tǒng)的10～20%。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡,、共聚焦掃描和電子顯微鏡等。

國內顯微鏡制造市場目前斷層嚴重,。目前我國顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術沉淀,，20年以上經(jīng)營積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造,、光學主要部件設計及工藝嚴重制約產(chǎn)業(yè)升級,。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司,、尼康、奧林巴斯等國外企業(yè),。國內具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù),，若國內顯微鏡企業(yè)能打破技術壁壘,，切入顯微鏡市場，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營將騰躍至一個更高的格局,。未來國產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大,。目前中國使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司,、尼康和奧林巴斯壟斷,。國內有能力開始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少，若國內能夠制造出高性能,、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡,，無異是會面臨極大的市場機遇。使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候,，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性,。進口多光子顯微鏡供應商

多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術中。還有其他類型的圖像對比提供有關樣本的有價值信息,。美國全自動多光子顯微鏡應用

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā),，光散射小（小粒子的散射與波長的四次方的成反比）,。不需要***,，能更多收集來自成像截面的散射光子。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好,。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點,。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質成像。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小,，熒光測定的信噪比更高。觀察活細胞∶離子測量（i.e.Ca2+）,，GFP,，發(fā)育生物學等—減少了光毒性和光漂白，能對細胞長時間觀察,。美國全自動多光子顯微鏡應用