多光子激發(fā)的特點(diǎn),。激發(fā)波長∶兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)激發(fā)，激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）,。多光子激發(fā)∶依賴于多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)的時(shí)間,。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16 seconds），且能提供更高的峰值功率,。熒光限制在焦點(diǎn)處,，能滿足多個(gè)光子同時(shí)達(dá)到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強(qiáng)度正比于（激光強(qiáng)度）n,。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器,，皮秒脈沖不能實(shí)現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高,、更窄脈沖輸出功率,。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū)，對(duì)細(xì)胞毒性和光漂白更小,。顯微鏡產(chǎn)品正拉動(dòng)市場需求,，多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｃ绹M(jìn)口多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí),，隨著刺激時(shí)間的增長，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平,。對(duì)于細(xì)胞受精過程中 Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中,，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及 Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義,。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂,、胞吐作用等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很的變化,。美國共聚焦多光子顯微鏡代理商顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡,。

通過添加FACED模塊,，可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng)。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描,，需要很少的計(jì)算處理,，在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用，并且不受串?dāng)_的影響,，而且對(duì)整個(gè)圖像平面采樣后可以進(jìn)行運(yùn)動(dòng)校正,。實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到光損傷的跡象，此外,，子脈沖延遲到達(dá)相同的樣品位置,，能為熒光團(tuán)提供充足的時(shí)間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài)，可以明顯減少光漂白,。使用現(xiàn)有的傳感器,，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來檢測神經(jīng)元過程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變，以及來自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓,。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡,，在小鼠大腦中實(shí)現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動(dòng)成像。在物鏡平均激光功率為10-85mW下,，他們測量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動(dòng),。

使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元,，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn),，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上,，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射,。通過射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對(duì)AOD,，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描,。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影,。目前,，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用,。雙光子顯微鏡采用長波長激發(fā),。

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢,。例如,，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實(shí)現(xiàn)對(duì)分子代謝的成像,，空間分辨率∶1-2mm，時(shí)間分辨率;分鐘量級(jí),。與PET比較,，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請(qǐng)參見表1-1）,，且具有更高的時(shí)間分辨率（秒級(jí)）,，空間分辨率可達(dá)到微米。因此,，二者相比,，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢,。對(duì)于小動(dòng)物（如小白鼠）研究來說,，光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物整體成像和在體基因表達(dá)成像。例如,，初步研究表明,，熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像。雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。美國共聚焦多光子顯微鏡代理商

多光子顯微鏡適用于動(dòng)物大腦皮層深層（400微米）細(xì)胞的形態(tài),、生理學(xué)研究。美國進(jìn)口多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

多光子顯微鏡對(duì)成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā),，光散射?。ㄐ×Ｗ拥纳⑸渑c波長的四次方的成反比）。不需要***,，能更多收集來自成像截面的散射光子,。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點(diǎn)區(qū)發(fā)射出的散射光子，多光子在深層成像信噪比好,。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對(duì)深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點(diǎn),。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對(duì)厚散射物質(zhì)成像。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小,，熒光測定的信噪比更高。觀察活細(xì)胞∶離子測量（i.e.Ca2+）,，GFP,，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白，能對(duì)細(xì)胞長時(shí)間觀察,。美國進(jìn)口多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析