多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足。只能對熒光成像,。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán),，如色素,，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低，雖然可以通過同時(shí)利用共焦的小孔得到改善，但是信號會(huì)有損耗。受昂貴的超快激光器限制,，多光子掃描顯微鏡的成本較高。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能,、動(dòng)物腦皮層的成像,、胚胎發(fā)育過程的長時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測、多光子激發(fā)光解籠,、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué),、多光子激發(fā)自發(fā)熒光、其它應(yīng)用,。多光子成像是一種非線性的過程,，信號產(chǎn)生要求功率密度達(dá)到MW/cm2的量級。美國全自動(dòng)多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

    與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能,，極大地促進(jìn)了研究人員對整個(gè)大腦深部神經(jīng)的認(rèn)識。2019年,，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像,、大數(shù)量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像三個(gè)方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù),。為了將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮層深處的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力,。激發(fā)光和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收,，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強(qiáng)度可以解決散射問題,，但會(huì)帶來其他問題,，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光,。另外，對于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號,。 美國高速高分辨率多光子顯微鏡技術(shù)多光子顯微鏡在臨床前評價(jià)IA形態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì),、細(xì)胞密度和血管形成等方面顯示出強(qiáng)大的作用,。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能,，這兩個(gè)優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像,、大量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像,，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題,，但這會(huì)帶來其他問題，例如燒壞樣品,、離焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。

作為一個(gè)多學(xué)科交叉,、知識密集,、資金密集的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)，多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué),、生物學(xué),、化學(xué)、物理學(xué),、電子學(xué),、工程學(xué)等學(xué)科，生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜,，進(jìn)入門檻較高,，是衡量一個(gè)國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。過去的5年,，多光子顯微鏡市場集中,，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多,。顯微鏡作為一個(gè)傳統(tǒng)的高科技行業(yè)，其作用至今沒有被其他技術(shù)顛覆,，只是不斷融合并發(fā)展相關(guān)技術(shù),，在醫(yī)療和其他精密檢測領(lǐng)域發(fā)揮著更大的作用。顯微鏡的商業(yè)化發(fā)展已進(jìn)入成熟期,，主要需求來自教學(xué),、生命科學(xué)的研究及精密檢測等，全球市場呈現(xiàn)平緩的增長態(tài)勢,。然而,，顯微鏡產(chǎn)品（如多光子顯微鏡,、電子顯微鏡）正拉動(dòng)市場需求，多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮?。多光子顯微鏡技術(shù)是對完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù),。

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點(diǎn)∶a.光損傷小∶雙光子熒光顯微鏡使用可見光或近紅外光作為激發(fā)光，對細(xì)胞和組織的光損傷很小,，適合于長時(shí)間的研究;b.穿透能力強(qiáng)∶相對于紫外光,，可見光或近紅外光具有很強(qiáng)的穿透性，可以對生物樣品進(jìn)行深層次的研究;c．高分辨率∶由于雙光子吸收截面很小P,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為λ范圍內(nèi);d.漂白區(qū)域很小，焦點(diǎn)以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象,。e．熒光收集率高,。與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器,，提高了熒光收集率,。收集效率提高直接導(dǎo)致圖像對比度提高。f.對探測光路的要求低,。由于激發(fā)光與發(fā)射熒光的波長差值加大以及自發(fā)的三維濾波效果,，多光子顯微鏡對光路收集系統(tǒng)的要求比單光子共焦顯微鏡低得多，光學(xué)系統(tǒng)相對簡單,。g.適合多標(biāo)記復(fù)合測量,。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)譜寬闊，這樣,，可以利用單一波長的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料,，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對照,、補(bǔ)充,。證實(shí)了多光子顯微鏡對皮膚和別的皮膚病的診斷的可行性。美國嚙齒類多光子顯微鏡能量脈沖

多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)中,。美國全自動(dòng)多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步,，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律,、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖,、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而,，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,，已經(jīng)對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入、細(xì)致的研究,，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測,。在細(xì)胞的生理過程中,，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的,、動(dòng)態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲取這些信息對與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要,。因此，發(fā)展能用于,、動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法非常必要,。美國全自動(dòng)多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)