與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能,，極大地促進了研究人員對整個大腦深部神經(jīng)的認識。2019年,，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像,、大數(shù)量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像三個方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù),。為了將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮層深處的神經(jīng)元進行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力,。激發(fā)光和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收,，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強度可以解決散射問題,，但會帶來其他問題,，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光。另外,，對于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。 多光子顯微鏡可以更好的了解神經(jīng)信號之間復(fù)雜動態(tài)的編碼過程,。美國離體多光子顯微鏡Ultima Investigator

世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本,，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為,，2020年,，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向,。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長,，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。國?nèi)顯微鏡制造市場目前斷層嚴重,。目前我國顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀，20 年以上經(jīng)營積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造,、光學(xué)重要部件設(shè)計及工藝嚴重制約產(chǎn)業(yè)升級,。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司,、尼康、奧林巴斯等國外企業(yè),。國內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù),，若國內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘，切入顯微鏡市場,，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營將騰躍至一個更高的格局,。美國離體多光子顯微鏡Ultima Investigator多光子激光掃描顯微鏡是建立在激光掃描顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上的實驗方法，三維觀察上提供更的光學(xué)切片能力,。

    1,，光源、光路高度整合通過精密的設(shè)計,，將飛秒激光器,、掃描振鏡、PMT,、濾光片組,，甚至是單光子熒光光路全套整合在一個不大的掃描頭（ScanHead）內(nèi)，無論掃描頭如何移動,，掃描頭內(nèi)的光路都可以保持穩(wěn)定不變,，從而實現(xiàn)了超穩(wěn)定、免維護的特點,。2,，配合多維度、高精度機械控制系統(tǒng),。掃描頭直接架設(shè)在一個多維運動的機械裝置上,，可沿任意方向和角度移動掃描頭，方便對動物樣本進行多方位的掃描觀察,。而這在常規(guī)方案的多光子顯微鏡上有很大的實現(xiàn)難度,，不但需要多個關(guān)節(jié)組合的光路導(dǎo)向機構(gòu)，并且在這些關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)的時候,，都冒著極大的光路偏移的風(fēng)險,，以至于在使用一段時間后都需要對光路進行再次校準，而這樣的問題在我司上則完全不會發(fā)生,。3.一機多能,。

以往我們認識的光電效應(yīng)是單光子光電效應(yīng),，即一個電子在極短時間內(nèi)能吸收到一個光子而從金屬表面逸出。強激光的出現(xiàn)豐富了人們對于光電效應(yīng)的認識,，用強激光照射金屬,，由于其光子密度極大，一個電子在短時間吸收多個光子成為可能,，從而形成多光子電效應(yīng),，這已被實驗證實。為什么一般討論的光電效應(yīng)都是指單光子光電效應(yīng)呢,？這是因為,，在使用普通光源的情況下，電子吸收兩個以上光子能量的概率是非常非常小的,，幾乎為零,。事實上，愛因斯坦本人就考慮過在強光下發(fā)生光電效應(yīng)的可能性問題,。對此,，他有如下的論述：光電效應(yīng)中的一個電子吸收兩個光子的幾率不會大于下雨天兩個雨滴同事打在一個螞蟻上的幾率。因此,，多光子光電效應(yīng)在實驗上的研究成為可能,，是二十世紀六十年代激光乃至強激光出現(xiàn)以后的事情。有了激光,，對于雙光子光電效應(yīng),，在實驗上和理論上均取得了許多成果。利用強激光,，人們不僅觀察到雙光子和三光子的光電效應(yīng),，甚至觀察到金靶材吸收幾十個等效光子實驗現(xiàn)象。帶寬足以覆蓋鈦藍寶石激光器的可調(diào)諧范圍和用于多光子顯微鏡的許多其它激光器的典型中心頻率,。

要想實現(xiàn)離散的軸向重新聚焦，需要在OBJ1的焦平面中放置一個階梯鏡（圖3b）,。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時,，被反射的激光將在無窮大的空間中成為準直光束，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑,。并且返回的激光束會被GSM消除橫向掃描,，即OBJ2形成的焦點不會進行橫向掃描，實現(xiàn)軸向掃描,。如果激光點被掃描到與焦平面不一致的階梯,，則會形成遠離鏡面的激光焦點，返回的激光束會在無窮大的空間中會聚或發(fā)散,，進而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點也在軸向重新聚焦,，通過這種方式即能實現(xiàn)離散的軸向掃描,。對于已精確匹配兩個物鏡光瞳的光學(xué)裝置，不會引入像差,。為了進行連續(xù)的軸向重新聚焦,，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡，同時入射的激光焦點也需要被傾斜,，使得其以垂直于鏡面的方向入射,，通過相對入射激光束稍微平移OBJ1即可實現(xiàn)這種傾斜。4tune光譜檢測器,，實現(xiàn)多光子顯微鏡的光譜型檢測,。美國bruker多光子顯微鏡配置

多光子顯微鏡在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用范圍正在持續(xù)增長。美國離體多光子顯微鏡Ultima Investigator

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā),，光散射?。ㄐ×Ｗ拥纳⑸渑c波長的四次方的成反比）。不需要***,，能更多收集來自成像截面的散射光子,。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點區(qū)發(fā)射出的散射光子，多光子在深層成像信噪比好,。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減,，不易對深層激發(fā)。多光子熒光成像的特點,。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質(zhì)成像,。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上，所以顯微試樣中的瑞利散射更小,，熒光測定的信噪比更高,。觀察活細胞∶離子測量（i.e.Ca2+），GFP,，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,，能對細胞長時間觀察。美國離體多光子顯微鏡Ultima Investigator