使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經元活動,，但神經元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

和很多偉大的科學發(fā)明一樣,，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然,，但正是那瞬間的靈感為生物科學尤其是神經科學帶來了一種**性的成像技術：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初,，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用,。當時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實驗,。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,，采集數(shù)據則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡是結合了雙光子技術和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,；

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經元成像,，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯,。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達到5毫米,，能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像,。根據清華大學單一采購來源的**指導意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來,，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見一斑。

細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性,。當個細胞興奮時,，產生了一個電沖動，此時,，細胞外的鈣離子流入該細胞內,，促使該細胞分泌神經遞質,，神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合，促使這一級神經細胞產生新的電沖動,。以此類推,，神經信號便一級一級地傳遞下去，從而構成復雜的信號體系,，終形成學習,、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM,，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知,，只有游離鈣才具有生物學活性,，而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定，同時也受鈣結合蛋白的影響,。細胞外鈣離子內流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等,。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來，以反映神經元活性,。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關的腦細胞,。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用；

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術的空間分辨率,，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝,；國內熒光激光雙光子顯微鏡應用

雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡,。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

美國霍華德·休斯醫(yī)學研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士較近成功將一種新的自適應光學的方法和雙光子顯微鏡結合，研制出一種新的自適應光學雙光子熒光顯微鏡,。通過校正小鼠大腦的像差,，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強度，明顯改進了成像質量,，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細節(jié)變得清晰可見,，她們成功將該方法應用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結構成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應光學方法,，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實,。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像視野是多少