使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡,、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。ultima雙光子顯微鏡代理商

研究人員通過用不同激光波長并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing）,，增加了相同時間內(nèi)可以成像的體積,，并同時保持較高的時間和空間分辨率。通過引入兩種波長不同的鈣信號熒光探針,，研究人員將神經(jīng)元群體的活動標記為兩個不同顏色,，并同時用兩個不同波長的激光激發(fā)探針，實現(xiàn)了兩個顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄,。為了實現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還分別在兩個激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng)，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）,。由此,，可以同時以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個平面，覆蓋縱深達600微米,，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達到2000個以上,。ultima雙光子顯微鏡代理商由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長時間的研究,。

配合雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收,，從而達到逐點掃描的效果,。

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡 FHIRM-TPM 2.0，其成像視野是該團隊于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時具備三維成像能力,，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達一個月的追蹤記錄,。在一批“早鳥項目”中,，該系統(tǒng)已被多個研究組應(yīng)用于不同的模式動物和行為范式，如小鼠的社交新穎性識別,、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化,、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項研究。雙光子顯微鏡能夠進行指標成像,；

2020年12月22日,，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持,。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進展”和“中國科學(xué)進展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具。美國激光熒光雙光子顯微鏡代理商

雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝,；ultima雙光子顯微鏡代理商

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。ultima雙光子顯微鏡代理商