新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國(guó)家重大科研儀器研制專(zhuān)項(xiàng)的一個(gè)碩果,。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性,，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國(guó)智造”隊(duì)伍,。目前,，該研發(fā)團(tuán)隊(duì)正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國(guó)家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，積極參與即將啟動(dòng)的中國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃,?？梢云诖⑿突p光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實(shí)現(xiàn)“分析腦,、理解腦,、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。國(guó)內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光毒性

1990年初,，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí),，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書(shū)，從中了解到非線(xiàn)性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用,。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒(méi)有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開(kāi)紫外,，換言之，與其通過(guò)一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過(guò)兩個(gè)雙倍波長(zhǎng)的可見(jiàn)光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建,，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。美國(guó)investigator雙光子顯微鏡成像原理雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖光,，是通過(guò)物鏡匯聚的。

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí),，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦,，提高了熒光檢測(cè)效率。

實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比,，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長(zhǎng)為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測(cè)試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,；

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米,，人類(lèi)大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。雙光子顯微鏡廠(chǎng)家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司,；國(guó)外熒光雙光子顯微鏡代理商

雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開(kāi)展對(duì)多種臟器的成像研究。國(guó)內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光毒性

單光子顯微技術(shù)是成熟的熒光顯微技術(shù),，但由于其使用的激發(fā)光波長(zhǎng)較短,，成像深度有限；能量較大,會(huì)造成對(duì)熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重,。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實(shí)現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描,成像速度慢,對(duì)樣本損害大,很難用于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像,。而寬場(chǎng)顯微鏡能夠很好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，但寬場(chǎng)顯微鏡由于離焦信號(hào)的干擾,難以實(shí)現(xiàn)多維成像,。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）,。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線(xiàn)性光學(xué)成像方法,采用長(zhǎng)波激發(fā)，能對(duì)組織進(jìn)行深層次成像,。常用的比較好激發(fā)波長(zhǎng)大多位于800-900nm,，而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對(duì)這個(gè)波段的光吸收率低,，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品,，因此背景第，光損傷小,，適用于在體檢測(cè),。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀(guān)察胞體,、樹(shù)突甚至單個(gè)樹(shù)突棘的活性,。研究者可完整的觀(guān)察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個(gè)樹(shù)突棘中的鈣分布。國(guó)內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光毒性