由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度,，在我們的實驗中,，時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制,。盡管在單點掃描系統(tǒng)中,，v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高,，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,，這主要是多聚焦成像和單點掃描技術之間的差異造成的,。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,，引入圖像掃描技術可以進一步提高空間分辨率,，這種技術需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現(xiàn),。除此之外，由于可見光區(qū)域的共振效應,，可能會產(chǎn)生光漂白,，因而為了延長觀察時間，系統(tǒng)還需要對激發(fā)強度和曝光時間做進一步優(yōu)化,。雙光子顯微鏡角膜成像,。國內(nèi)雙光子顯微鏡成像視野

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短激發(fā)態(tài)后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。因其光損傷小,、樣本透射深等優(yōu)勢，使得觀察熒光細胞成為可能,。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的***成像研究,。以小鼠顱內(nèi)***成像為優(yōu)勢，可動態(tài)**觀察小鼠顱內(nèi)神經(jīng)細胞、小膠質細胞/巨噬細胞,、周細胞,、血管、轉移瘤細胞,、膠質瘤細胞等的變化情況,，在**學、神經(jīng)生物學,、發(fā)育生物學,、神經(jīng)退行性疾病等領域具有廣泛應用。小鼠其它組織臟器,，如脾,、肺、顱骨,、股骨,、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,。

王愛民副教授結合工作實例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應用,。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克,，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部,，可實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元,、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號，在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學研究和醫(yī)療領域應用有較大的應用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進行細胞和組織結構成像,，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠實時,、在體、原位,、無創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標成像,，在無造影劑的前提下,，利用自發(fā)熒光、二次諧波,、熒光獲得活細胞生化信息,。

2020年，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術報告,。學術報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學信息科學技術學院副教授,，畢業(yè)于北京大學物理系,，獲學士,、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用,，為未來即時病理,、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢,，可以在小鼠的的任何部位進行成像。

細胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性,。當個細胞興奮時,，產(chǎn)生了一個電沖動，此時,，細胞外的鈣離子流入該細胞內(nèi),，促使該細胞分泌神經(jīng)遞質，神經(jīng)遞質與相鄰的下一級神經(jīng)細胞膜上的蛋白分子結合,，促使這一級神經(jīng)細胞產(chǎn)生新的電沖動,。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去,，從而構成復雜的信號體系,，終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質的過程必不可少,。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學活性,，而細胞質內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關的腦細胞,。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應,。進口2PPLUS雙光子顯微鏡

雙光子顯微鏡有哪些分類呢？國內(nèi)雙光子顯微鏡成像視野

光學顯微鏡和電子顯微鏡本質的區(qū)別在于,，光學顯微鏡：用的是可見光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別,，在于一個基本的原理，光的衍射,。,。。光波是一個有趣的東西,，其中有一項,，如果物體的體積小于光的波長，光一般可以繞過去,，不發(fā)生明顯變化,。也就是說，有這個物體和沒這個物體,，在這種情況下,，光是不會發(fā)生明顯改變的?？梢姽獾牟ㄩL（肉眼）：380～780納米,，也就是，如果比380納米還要小的東西,，用光學顯微鏡,，無論你放大多少倍,，也是看不見的。因為光繞過去了,。,。。光的衍射為了克服這個問題,，科學家用波長更短的光去照射物體,，也是就被觀測物。比如10納米級的光,，這樣,，就能看到我們用肉眼無論如何都看不見的東西。這就是電子顯微鏡多說一句,，光速是不變的,。光速=頻率×波長。波長越短,，頻率越大,。。頻率越大,，光波的能量越大,。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大，能看到的東西越小,。顏色取決于物體能反射光的波長的長短當你看到的物體小于較小可見光的波長，那它就是沒有顏色的,。,。。因為顏色是肉眼對于可見光頻率在大腦中的投影,。,。。,。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎?。。,。沒有顏色不是透明的意思,，它們不是肉眼可見顏色的定義中包含的。國內(nèi)雙光子顯微鏡成像視野