我們要指出的是，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光,，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu),，其目的是為了,，通過共焦結(jié)構(gòu)，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率,。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同,，實現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平,。這樣就可以簡化整個系統(tǒng),，相對來說，就提高了激發(fā)光源的利用率,，以及熒光的探測效率,，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu),，分辨率則會更高,，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。點掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質(zhì)量的圖像,，但這個過程極其緩慢,，因為圖像是一次形成一個點。美國激光掃描多光子顯微鏡成像區(qū)域

要想實現(xiàn)離散的軸向重新聚焦,，需要在OBJ1的焦平面中放置一個階梯鏡（圖3b）,。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時，被反射的激光將在無窮大的空間中成為準(zhǔn)直光束,，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑,。并且返回的激光束會被GSM消除橫向掃描，即OBJ2形成的焦點不會進(jìn)行橫向掃描，實現(xiàn)軸向掃描,。如果激光點被掃描到與焦平面不一致的階梯,，則會形成遠(yuǎn)離鏡面的激光焦點，返回的激光束會在無窮大的空間中會聚或發(fā)散,，進(jìn)而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點也在軸向重新聚焦,，通過這種方式即能實現(xiàn)離散的軸向掃描。對于已精確匹配兩個物鏡光瞳的光學(xué)裝置,，不會引入像差,。為了進(jìn)行連續(xù)的軸向重新聚焦，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡,，同時入射的激光焦點也需要被傾斜,，使得其以垂直于鏡面的方向入射，通過相對入射激光束稍微平移OBJ1即可實現(xiàn)這種傾斜,。美國清醒動物多光子顯微鏡能量脈沖光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。

作為一個多學(xué)科交叉,、知識密集、資金密集的高技術(shù)產(chǎn)業(yè),，多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué),、生物學(xué)、化學(xué),、物理學(xué),、電子學(xué)、工程學(xué)等學(xué)科,，生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜,，進(jìn)入門檻較高，是衡量一個國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標(biāo)準(zhǔn)之一,。過去的5年,，多光子顯微鏡市場集中，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。顯微鏡作為一個傳統(tǒng)的高科技行業(yè),，其作用至今沒有被其他技術(shù)顛覆,，只是不斷融合并發(fā)展相關(guān)技術(shù)，在醫(yī)療和其他精密檢測領(lǐng)域發(fā)揮著更大的作用,。顯微鏡的商業(yè)化發(fā)展已進(jìn)入成熟期,，主要需求來自教學(xué),、生命科學(xué)的研究及精密檢測等，全球市場呈現(xiàn)平緩的增長態(tài)勢,。然而,，顯微鏡產(chǎn)品（如多光子顯微鏡、電子顯微鏡）正拉動市場需求,，多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

    繼首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后,，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力,，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個神經(jīng)元進(jìn)行成像,，實現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個月追蹤記錄。通過對微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計系統(tǒng)的,。微物鏡工作距離延長至1mm，實現(xiàn)無創(chuàng)成像,。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊,，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實時成像。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成,，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定,。其變焦模塊重量，研究人員可根據(jù)實驗需求自由拆卸,。此外,，新版微型化成像探頭可整體即時拔插，極大地簡化了實驗操作,，避免了長周期實驗時對動物的干擾,。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角小于,，邊界偏差小于35微米,。 多光子顯微鏡市場集中，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。

通過添加FACED模塊,，可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng),。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描，需要很少的計算處理,，在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用,，并且不受串?dāng)_的影響，而且對整個圖像平面采樣后可以進(jìn)行運動校正,。實驗中沒有觀察到光損傷的跡象,，此外,，子脈沖延遲到達(dá)相同的樣品位置，能為熒光團(tuán)提供充足的時間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài),，可以明顯減少光漂白,。使用現(xiàn)有的傳感器，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來檢測神經(jīng)元過程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變,，以及來自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓,。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡，在小鼠大腦中實現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動成像,。在物鏡平均激光功率為10-85mW下,，他們測量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡,。美國激光掃描多光子顯微鏡成像區(qū)域

世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本,，德國是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司。美國激光掃描多光子顯微鏡成像區(qū)域

國內(nèi)顯微鏡制造市場目前斷層嚴(yán)重,。目前我國顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀,，20年以上經(jīng)營積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造,、光學(xué)主要部件設(shè)計及工藝嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)升級,。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司,、尼康、奧林巴斯等國外企業(yè),。國內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù),，若國內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘，切入顯微鏡市場,，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營將騰躍至一個更高的格局,。未來國產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。目前中國使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司,、尼康和奧林巴斯壟斷。國內(nèi)有能力開始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少,，若國內(nèi)能夠制造出高性能,、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡，無異是會面臨極大的市場機(jī)遇,。美國激光掃描多光子顯微鏡成像區(qū)域