單光子顯微技術(shù)是成熟的熒光顯微技術(shù),，但由于其使用的激發(fā)光波長較短,，成像深度有限；能量較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴重,。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細胞成像,。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應用于活細胞內(nèi)的實時檢測，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像,。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）,。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學成像方法,采用長波激發(fā)，能對組織進行深層次成像,。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm,，而水、血液和固有組織發(fā)色團對這個波段的光吸收率低,，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品,，因此背景第，光損傷小,，適用于在體檢測,。雙光子熒光成像技術(shù)能準確定位細胞內(nèi)置入的微電極位置,，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性,。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細胞單個樹突棘中的鈣分布,。成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設備。熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少

臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術(shù)報告,。學術(shù)報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學信息科學技術(shù)學院副教授,，畢業(yè)于北京大學物理系，獲學士,、碩士學位,，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被Nature Methods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應用，為未來即時病理,、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。進口熒光激光雙光子顯微鏡商家雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物,。

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對***細胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，較大降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究；

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動,，隨著功能光學成像技術(shù)的發(fā)展,，神經(jīng)學家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一,，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內(nèi)游離鈣離子濃度,，以此細胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化,，從而判斷其功能活動,。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡之中時間和空間上的傳遞穿梭。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗,；

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像,。美國熒光激光雙光子顯微鏡圖像對比度

雙光子顯微鏡有哪些應用呢,？熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少

要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞,，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細胞,，使掃描能更好地進行。熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少