BstDNAPolymerase,LargeFragment（嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶大片段）是一種經(jīng)過改造的酶,，它來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶I,，通過重組技術(shù)在大腸桿菌中表達并純化獲得。這種酶具有5'→3'的DNA聚合酶活性,，但不具有5'→3'的核酸外切酶活性，因此它在等溫擴增反應中非常有用,，如環(huán)介導的等溫擴增（LAMP）和滾環(huán)擴增（RCA）等,。以下是BstDNAPolymerase,LargeFragment的一些關(guān)鍵特點和應用：1.**等溫擴增**：BstDNAPolymerase,LargeFragment具有很強的鏈置換能力，適用于多種等溫擴增反應,，這些反應通常在50-68°C之間進行,，比較好反應溫度為65°C。2.**快速測序**：由于其高聚合酶活性,，BstDNAPolymerase,LargeFragment可以用于快速測序,，特別是對于高GC含量的DNA模板或微量（納克量級）DNA模板的測序。3.**全基因組擴增**：BstDNAPolymerase,LargeFragment也可用于全基因組擴增（WGA）,，這是一種在不需要熱循環(huán)儀的情況下擴增整個基因組DNA的技術(shù),。4.**高dUTP耐受性**：與BstDNAPolymerase2.0相比,，BstDNAPolymerase,LargeFragment在進行等溫擴增時不具有將dUTP摻入合成的DNA鏈的能力，這使得它在某些應用中更具優(yōu)勢,。CRISPR/Cas12a 是一種單一的RNA引導的核酸內(nèi)切酶,，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)為靶向基因組工程提供了新的機會。Recombinant Mouse tPAProtein,hFc Tag

在質(zhì)粒DNA提取過程中,，確保DNA的完整性和活性至關(guān)重要,，這通常涉及以下幾個關(guān)鍵因素：1.**溫和的裂解條件**：選擇適當?shù)牧呀夥椒▽τ诒３諨NA的完整性至關(guān)重要。對于大于15kb的質(zhì)粒DNA,，應采用溫和的裂解方法,，如將細菌懸浮于等滲的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破壞細胞壁和細胞膜,，以減少對質(zhì)粒DNA的機械剪切力,，從而保護其完整性。2.**避免過度裂解**：在質(zhì)粒提取過程中,，并非裂解時間越長越好,。過長的裂解時間可能會造成基因組DNA片段的污染，影響質(zhì)粒的純度,。3.**適當?shù)南礈旌拖疵?*：在純化過程中,，適當?shù)南礈炜梢匀コ鞍踪|(zhì)和其他雜質(zhì)，但過度洗滌可能會導致DNA的損失,。洗脫步驟中,，確保洗脫液完全浸潤柱膜，以保證結(jié)合在柱膜上的質(zhì)粒得以充分洗脫,，避免因洗脫體積過小而影響質(zhì)粒得率,。4.**避免DNA的降解**：在提取過程中，添加核酸酶抑制劑可以防止DNA被核酸酶降解,。同時,，避免長時間將DNA暴露在室溫下，以及避免多次凍融循環(huán),，這些都有助于保護DNA的完整性,。5.**低溫操作**：盡量在低溫條件下進行提取操作，以減少核酸酶的活性,，從而保護DNA的完整性,。

在比較BstDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶對于復雜DNA片段擴增的適用性時,，以下是一些關(guān)鍵點：1.**TaqDNA聚合酶**：-TaqDNA聚合酶因其高熱穩(wěn)定性和擴增效率而被應用于常規(guī)PCR,。它擴增速度為30-60秒/kb，缺乏3'→5'核酸外切酶活性,，無校正功能,，易產(chǎn)生錯配堿基,。-對于結(jié)構(gòu)復雜的模板，如GC含量高,、有二級結(jié)構(gòu)等,，TaqPlus可以用于擴增，能有效地擴增10kb以下的片段,。-有產(chǎn)品如TitaniumTaqDNA聚合酶,，它是通過基因工程改造的Taq酶，缺失了5'-3'外切酶活性,，具備更強大的擴增性能,，適合擴增高度復雜的DNA混合物,。2.**BstDNA聚合酶**：-BstDNA聚合酶具有高適溫度,，能夠適應更加苛刻的擴增條件，同時消除DNA二級結(jié)構(gòu),，因而能夠準確并且均勻地擴增全基因組序列,。-BstDNA聚合酶大片段能夠優(yōu)先擴增短片段的DNA，并且能夠確保擴增得到的DNA覆蓋了整個基因組,，連貫并且無偏地擴增所有的遺傳位點,。-翌圣生物HieffCanace®PlusHigh-FidelityDNAPolymerase基于PfuDNA聚合酶改造而成，其保真性是Taq酶的83倍,，Pfu酶的9倍,，擴增速度高達10秒/kb，擴增目的片段長達13kb,，具有極強的擴增效率的模板適應性,，非常適合復雜模板的高保真擴增。

牛痘DNA拓撲異構(gòu)酶I（VacciniaVirusDNATopoisomeraseI）在實驗室中的使用主要涉及以下幾個步驟：1.**DNA載體連接**：-牛痘DNA拓撲異構(gòu)酶I可以用于DNA載體連接,，特別是在TOPO克隆載體制備中,。它能夠識別并切割雙鏈DNA末端[5’C(T)CCTT]，并與DNA形成共價連接形成穩(wěn)定復合物,，遇到DNA的5’-OH基團后,，重新連接形成完整DNA鏈。2.**接頭連接**：-在NGS建庫中,，牛痘DNA拓撲異構(gòu)酶I可用于接頭連接,。這包括將含有特定序列的接頭A和接頭B與酶一起孵育，以實現(xiàn)DNA片段的連接,。3.**操作步驟**：-**質(zhì)粒解旋**：將超螺旋質(zhì)粒DNA與牛痘DNA拓撲異構(gòu)酶I混合,，在37°C下孵育5-15分鐘，以實現(xiàn)質(zhì)粒的解旋,。-**接頭連接**：將接頭A（含CCCTT序列）和接頭B（含5’OH）與牛痘DNA拓撲異構(gòu)酶I混合,，在37°C下孵育5-15分鐘,，以實現(xiàn)接頭的連接。4.**注意事項**：-雙鏈接頭A通常5’端做NH2封閉修飾,，以防止自連接,；接頭A的CCCTT后通常包含5-12bp尾巴，再長的尾巴會導致連接效率大幅下降,。-雙鏈接頭B的5’端必須包含-OH,。-由于該酶應用廣，在不同的實驗中使用策略不同,，需要靈活運用,，并根據(jù)具體文獻進行調(diào)整。

牛痘DNA拓撲異構(gòu)酶I是TOPO克隆技術(shù)的關(guān)鍵組分,，該技術(shù)允許快速,、簡便地將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體中。

Cre重組酶在基因編輯中的操作主要涉及以下幾個步驟：1.**識別與結(jié)合**：-Cre重組酶首先識別并分別結(jié)合兩個LoxP序列的兩個反向重復序列,，形成一個二聚體,。2.**四聚體形成**：-兩個二聚體互相靠近，形成由四個Cre分子與兩個LoxP位點結(jié)合形成的四聚體復合物,。3.**DNA切割與交換**：-Cre重組酶在每個LoxP位點的間隔序列中引導單鏈切割,，產(chǎn)生帶有3’端羥基的斷裂。每個LoxP位點的兩個單鏈分別被切割,。切割產(chǎn)生的自由3’端與對側(cè)的3’端進行交換和重連,，形成Holliday交叉結(jié)構(gòu)。4.**分子重組與解旋**：-Holliday交叉結(jié)構(gòu)通過Cre酶的作用被解旋并重組,，形成新的重組產(chǎn)物,。這個過程導致兩個LoxP位點之間的DNA序列被刪除、反轉(zhuǎn)或易位,，具體效果取決于LoxP序列的排列方式（方向和位置）,。5.**條件性基因編輯**：-通過建立特異性Cre小鼠，該小鼠中的Cre重組酶由特定啟動子驅(qū)動,，可在特定細胞或組織或全身表達Cre重組酶,。與帶有Lox位點的Flox小鼠雜交，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠,，實現(xiàn)條件性基因打靶（表達或敲除靶基因）,。Probe qPCR Mix (2×) 支持多重qPCR，即在單個反應中同時檢測多個靶標基因 ,。Recombinant Human CYTL1/C17 Protein,hFc Tag

Pfu DNA Polymerase 適合擴增較長的DNA片段,，有助于在基因編輯中處理大的基因區(qū)域或復雜的基因結(jié)構(gòu)。Recombinant Mouse tPAProtein,hFc Tag

Lambda核酸外切酶（LambdaExonuclease,，簡稱λExonuclease）是一種具有特定特性和應用的酶,，以下是其主要特點和應用：1.**特異性作用**：λExonuclease是一種5'→3'核酸外切酶,，能選擇性地沿5'→3'方向消化5'端磷酸化的雙鏈DNA。2.**酶切活性**：對單鏈DNA和5'端未磷酸化修飾的DNA的酶切活性較低,，不能從DNA的切刻或缺口處起始消化,。3.**嗜磷酸性**：該酶具有非常強的嗜磷酸性，磷酸化的核酸鏈與非磷酸化的核酸鏈的切割效率相差達200倍以上,。4.**切割效率**：Lambda核酸外切酶是一種具有高度持續(xù)性的堿性核酸外切酶,，可以連續(xù)地將核酸切割成為單個堿基，切割比較高速率可以達到1000nt/S,。5.**應用領(lǐng)域**：-生成單鏈PCR產(chǎn)物用于DNA測序,。-DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。-滾環(huán)擴增,。-從雙鏈DNA片段生成單鏈DNA,。-PCR產(chǎn)物的克隆。-質(zhì)粒制備凈化,。6.**酶活性定義**：Oneunitisdefinedastheamountofenzymerequiredtoproduce10nmolofacid-solubledeoxyribonucleotidefromdouble-strandedsubstrateinatotalreactionvolumeof50μlin30minutesat37oCin1XLambdaExonucleaseReactionBufferwith1μgsonicatedduplex[3H]-DNA,。Recombinant Mouse tPAProtein,hFc Tag