單細(xì)胞RNA-seq,、RNA-seq和逆轉(zhuǎn)錄qPCR（RT-qPCR）都采用一個(gè)共同過(guò)程，即分離RNA并將其轉(zhuǎn)化為cDNA進(jìn)行分析,。不過(guò),，每種分析在開展方式和獲得的數(shù)據(jù)上有所不同。RNA-seq和RT-qPCR都是先從大量細(xì)胞中分離RNA,，然后將其轉(zhuǎn)化為cDNA,。RNA-seq是使用cDNA來(lái)構(gòu)建新一代測(cè)序文庫(kù)，從而測(cè)定整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá),。RT-qPCR則是從cDNA中擴(kuò)增特定靶點(diǎn),，并通過(guò)熒光測(cè)定表達(dá)水平。RT-qPCR限于已知靶點(diǎn),，而RNA-seq可實(shí)現(xiàn)無(wú)偏倚的全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析,。然而，這兩者只能提供細(xì)胞群體內(nèi)基因表達(dá)的平均情況,。單細(xì)胞RNA-seq則在分離RNA之前將單細(xì)胞分離到微孔或單個(gè)微反應(yīng)容器中,。然后用細(xì)胞特異性的條形碼標(biāo)記RNA，確保來(lái)自每個(gè)細(xì)胞的cDNA可以追溯到起源細(xì)胞,。與RNA-seq相似,，帶有條形碼的cDNA也被用于構(gòu)建新一代測(cè)序文庫(kù)，從而能夠?qū)γ總€(gè)細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定,。烈冰單細(xì)胞測(cè)序,，助力您的深入科學(xué)探究。南京二代測(cè)序單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)

針對(duì)樣本活性的問(wèn)題,，10×Genomics官方建議當(dāng)單細(xì)胞懸液活性低于70%時(shí)應(yīng)做去除死細(xì)胞操作,，但也需要注意到，去除死細(xì)胞的操作會(huì)損失一定的細(xì)胞數(shù)量,，10×Genomics和MiltenyiBiotec都沒有給出單細(xì)胞懸液含有多少細(xì)胞數(shù)量才建議做去除死細(xì)胞的操作,。基于烈冰多年單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)經(jīng)驗(yàn),，建議當(dāng)細(xì)胞懸液進(jìn)行質(zhì)量和活性檢測(cè)后,，考慮對(duì)細(xì)胞活性在50%-70%的懸液進(jìn)行去除死細(xì)胞的操作。而太低活性的懸液（小于30%）,，懸液中細(xì)胞大量死亡,，可能已經(jīng)丟失了原組織內(nèi)的細(xì)胞比例和狀態(tài)，失真嚴(yán)重,，建議重新收集樣本進(jìn)行新的實(shí)驗(yàn),，保證數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。上海烈冰單細(xì)胞測(cè)序烈冰對(duì)于一個(gè)細(xì)胞群體中的每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序分析,。

樣本制備后的保存為了盡可能地減少轉(zhuǎn)錄組的變化,，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗和計(jì)數(shù)后,，單細(xì)胞懸液應(yīng)當(dāng)保存于冰上，直至用于后續(xù)的上機(jī)和文庫(kù)制備步驟,。在理想狀況下,，一旦制備好樣本，應(yīng)當(dāng)在3min鐘內(nèi)將其用于下游步驟,。然而,，您還有必要了解各類細(xì)胞的不同性質(zhì)，因?yàn)檫@可能會(huì)影響細(xì)胞應(yīng)在冰上保存的時(shí)間,，以及它們?cè)谥苽浜蠖嗑帽銘?yīng)當(dāng)被盡快使用。例如,，有些細(xì)胞（如PBMC）如果在冰上放置一段時(shí)間,，它們就開始形成團(tuán)塊。這些團(tuán)塊很難解離,，增加了堵塞的風(fēng)險(xiǎn),，而且每個(gè)團(tuán)塊被當(dāng)成單細(xì)胞計(jì)數(shù)，又降低了細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性,。此外,，有些細(xì)胞更加粘稠，形成團(tuán)塊的速度更快,。對(duì)于這些細(xì)胞,，必須盡量減少制備和使用之間的時(shí)間差

細(xì)胞中基因的表達(dá)是嚴(yán)格按照時(shí)間和空間順序發(fā)生，因此細(xì)胞類型和基因表達(dá)具有時(shí)間特異性和空間特異性,。時(shí)間特異性可以通過(guò)收集不同時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)分析,。但是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-Seq）在單細(xì)胞懸液制備的過(guò)程中破壞了細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)，無(wú)法給出固態(tài)異質(zhì)化組織中細(xì)胞空間排布信息,。而空間轉(zhuǎn)錄組可以解決這個(gè)問(wèn)題,，其以點(diǎn)陣形式記錄組織切片細(xì)胞的空間信息，在保留組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,，獲得細(xì)胞/基因的空間表達(dá)特異性,。截至2021年10月，烈冰助力發(fā)表單細(xì)胞測(cè)序文章近20篇,。

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單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)提供了單個(gè)細(xì)胞水平下的科學(xué)研究視角,。南京二代測(cè)序單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)

10XGenomics和Drop-Seq具有類似的技術(shù)原理。從橫向孔道中逐一輸入凝膠微珠,，一列縱向孔道輸入細(xì)胞,，凝膠微珠與細(xì)胞碰撞后會(huì)吸附在凝膠微珠上，并通過(guò)微流控技術(shù),，將之輸入到第二縱向孔道,，即油相孔道中。這時(shí)候,，就形成了一個(gè)個(gè)油滴并輸出并收集在EP管中,。每一個(gè)油滴中會(huì)落入一個(gè)細(xì)胞以及一個(gè)凝膠微珠，那么在每一個(gè)凝膠微珠中上長(zhǎng)滿了不同的CellBarcode和UMIBarcode連接形成的序列,，再加上一端PolyT的抓手,，構(gòu)成我們的捕獲凝膠微珠。而這個(gè)凝膠微珠抓手就會(huì)使用oligodT抓住mRNA構(gòu)建文庫(kù),。南京二代測(cè)序單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)

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