用吸管吸出細胞懸液,，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻,；離心,，1000rpm，5min,；棄去上清液,，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù),，調整細胞密度,，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),；次日更換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項：取錯細胞：拿錯凍存管,。（快快快,，匆忙之中，難免出錯,，況且－170多度,，凍手！）解決：（1）核查記錄冊及凍存管上細胞的名稱、時間是否一致,。（2）拿細胞時戴手套,！2.水浴時間太長：2min還沒融化。（凍存管的壁較厚,，隔熱）解決：（1）適當提高水浴溫度（37度－40度）,。（2）要是冬天，就選用保溫盒,。3.冰盒內時間太長：復蘇1h后,，還沒有加入新的培養(yǎng)液。（高濃度DMSO防止胞內形成冰晶,，凍存時保護細胞,，但復蘇融解后，浸泡時間太久會,，對細胞有毒性）解決：提前預定超凈臺,，減少復蘇后插在冰盒里等待的時間。4.失去耐心：復蘇三四天后,，細胞沒有任何動靜,，認為失敗，倒掉所有細胞,。（有些細胞復蘇后一星期,，才有起色）解決：不要換液，耐心等待,，兩周后再做決定,。一、細胞凍存液1.無血清細胞凍存液產(chǎn)品概述:一種即用型,、無需程序降溫的細胞凍存液,適用于哺乳動物低溫保存,。無需配制，使用簡單,，細胞復活率高,。產(chǎn)品特點：(1)安全：無血清。無血清細胞凍存液應細胞復蘇率高達90%以上,。浙江原代細胞凍存液配制比例

    去除舊培養(yǎng)液,，用PBS清洗1-2次；去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清,；3,、加入適量胰酶（濃度一般為），使胰酶覆蓋整個瓶,，放入培養(yǎng)箱消化,；4,、細胞消化（具體時間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細胞,，細胞胞質回縮，細胞間不再連接成片,，此時加入完全培養(yǎng)基終止消化,；5、用巴氏吸管輕輕吹打細胞,，形成細胞懸液,，將細胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min；6,、棄上清,，加入適量預先配制好的凍存液，巴氏吸管輕輕吹打使細胞均勻,，計數(shù),，調節(jié)凍存液中的細胞更終密度為5×106/ml～1×107/ml；7,、將細胞分裝入凍存管中,，每管；8,、凍存管標記細胞名稱,，凍存時間，操作者及細胞代數(shù)信息,。對于懸浮細胞凍存,，則直接收集離心細胞，除去胰酶消化的步驟,，其他步驟相同,。注意事項1、需凍存保種的細胞應在生長良好且存活率高,，其密度約為80-90％的狀態(tài),。細胞凍存前應保證細胞的活力好，無污染,。2,、在細胞凍存過程中，所結的冰晶對細胞傷害較大,，所以過程一定要慢,。凍存或者復蘇更好用新配制的培養(yǎng)液。無錫內皮細胞凍存液使用說明無血清細胞凍存液研究領域,。

    有些則不需要,。降溫盒須恢復室溫后再使用,。根據(jù)普諾賽實驗室細胞培養(yǎng)經(jīng)驗，使用程序凍存盒凍存效果良好,，沒有凍存盒的同學可以參照下文方法二和方法三,。操作步驟步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預冷步驟2：離心收集對數(shù)生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心,，懸浮細胞直接離心,，轉速1200rpm或250g，時間3min）步驟3：用配制好的凍存液重懸細胞,，按照1~,，擰緊管蓋，做好標記步驟4：凍存管放入凍存盒,，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）步驟5：凍存管從凍存盒取出,，轉移至液氮長期保存方法二：使用無血清非程序凍存液無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無需自己配制,，無需降溫盒,，**提升了便捷性。但是,，并非所有細胞都適用于這種凍存液,，使用前必須做凍存測試，沒問題后再批量應用,。操作步驟步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液,，待用步驟2：離心收集對數(shù)生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心,，轉速1200rpm或250g,，時間3min）步驟3：棄上清，加入適量無血清非程序凍存液,，重懸細胞步驟4：按照1~,，擰緊管蓋，做好標記步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中,。

    隔夜取出凍存管直接放液氮凍存,。或直接采用程序性降溫盒更為方便,。作者：非**研究僧鏈接：zhuanlan./p/來源：知乎著作權歸作者所有,。商業(yè)轉載請聯(lián)系作者獲得授權，非商業(yè)轉載請注明出處,。1,、細胞活力及濃度細胞應在生長良好、致密度約為80-90％,、數(shù)目一般為106-107/ml,，活力達90%以上的狀態(tài)下凍存,。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此,，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存,。2、注意冷凍保護劑之品質DMSO應為試劑級等級,，無菌且無色,，可以用微米濾膜過濾，或者直接購買無菌產(chǎn)品,。以5-10ml小體積分裝，4℃避光保存,，勿作多次解凍,。使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌,，它本身就有滅菌的作用,。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至于降低冷凍保存效果,。在常溫下,，DMSO對人體有害，故在配制時**好帶上手套,?；靹駾MSO要快，因為DMSO對細胞有毒性,，混合后應盡快凍存,。尤為值得注意的是細胞中加入凍存液后，一定要混勻,，防止DMSO沉淀,。3、提前配制凍存液凍存液應該提前配制,，置于室溫備用,，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細胞。4,、實行細胞慢凍的原則緩慢冷凍,，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產(chǎn)生大的冰晶,，導致細胞損害,。對于大多數(shù)細胞來說，每分鐘降1-3℃是合適的,。相反,。100ml無血清細胞凍存液儲存條件是2-8℃下12 個月,。

    從上述的一些保存方式來看，無血清的細胞凍存液具有比較明顯的優(yōu)勢,，具有非常明顯的通用性,，而且在保存細胞的過程中比較簡單，不用切換保存的環(huán)境,，所以對于細胞的保存可以更加的安全,、高效。而且無血清細胞凍存液避免了細胞產(chǎn)生大量的死亡,，存活率比較高,。目前，細胞凍存**常用的技術是液氮冷凍保存法,，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞,。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶,，從而引起一系列不良反應,。如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變,，部分蛋白質由于上述原因而變性,，引起細胞內部空間結構紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶,，使細胞內結構成分造成破壞,，線粒體腫脹，功能丟失,，并造成能量代謝障礙,。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內容物丟失,。如果細胞內冰晶形成較多,，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發(fā)生不可逆的損傷,，而致細胞死亡,。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分,，減少細胞內冰晶的形成,。通常采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作保護劑（滲透型），這兩種物質分子量小,，溶解度大,，易穿透細胞，可以使冰點下降,。做無血清細胞凍存液的合作平臺有哪些,？EKBIO Tech細胞凍存液保質期

無血清細胞凍存液在2-8℃穩(wěn)定保存1年以上,。浙江原代細胞凍存液配制比例

    提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性,。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外,，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷,。對于一些原代細胞（皮膚細胞）,，除滲透型保護劑外，還會適當添加表面型保護劑（海藻糖）,，以提高細胞存活率,。所需材料?超低溫冰箱或液氮罐??20%以上血清的完全培養(yǎng)液或血清?DMSO(分析純)或無色新鮮甘油(121℃蒸氣高壓消毒)?2ml**細胞凍存管?吸管、離心管,、噴燈,、凍存管架貼壁細胞的凍存1．選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前*****好換液,。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用胰蛋白酶消化,。適時去掉胰蛋白酶,，加入等量完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞,，使其成為均勻分散的細胞懸液,。然后將細胞收集于離心管中離心(200g，5分鐘),。2．去上清液,，加入含20%以上小牛血清的完全培養(yǎng)基或血清，于4℃預冷15分鐘后,，加入10%的DMSO,，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，分裝于細胞凍存管,，細胞濃度為3×106～1×107/ml之間,。3．將上述細胞分裝于凍存管中，將蓋子蓋緊,，并標記好細胞名稱和凍存日期,，同時作好登記(日期、細胞種類及代次,、凍存支數(shù)),。4．先將凍存管置入置于4℃30min，再轉入-20℃2h后,。浙江原代細胞凍存液配制比例

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