本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：,，尤其涉及一種細(xì)胞凍存液，具體涉及一種用于干細(xì)胞的凍存液,。背景技術(shù)：：臍帶血是胎兒娩出,、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤(pán)和臍帶中的血液，通常是廢棄不用的,。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn),，臍帶血中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞,，可用于造血干細(xì)胞移植，***80多種疾病,。因此,，臍帶血已成為造血干細(xì)胞的重要來(lái)源，特別是無(wú)血緣關(guān)系造血干細(xì)胞的來(lái)源,。也是一種非常重要的人類(lèi)生物資源,。干細(xì)胞***是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，再將其移植入患者受損或缺損組織中,，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷組織的補(bǔ)充和修復(fù),。目前干細(xì)胞采集后，需要加入保存液進(jìn)行冷凍保存,，細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存過(guò)程中的**試劑,，關(guān)系到細(xì)胞復(fù)蘇后的活性及數(shù)量等問(wèn)題，現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液,，一方面營(yíng)養(yǎng)成分單一,，配比不當(dāng)，導(dǎo)致細(xì)胞存活率低,、穩(wěn)定性差；另一方面大多都是異種血清,，會(huì)引入外源蛋白從而增加細(xì)胞污染和過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn),，不適用于臨床。因此,，為有效開(kāi)展干細(xì)胞移植及建立干細(xì)胞庫(kù),，亟需開(kāi)發(fā)一種成本低、細(xì)胞存活率高,、成分簡(jiǎn)單的細(xì)胞凍存液,，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,。無(wú)血清細(xì)胞凍存液和什么相關(guān),？常州原代細(xì)胞凍存液配方

    對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,。實(shí)施例1細(xì)胞凍存液的制備以1l體積為標(biāo)準(zhǔn),，按照下列組分的含量，稱(chēng)取對(duì)應(yīng)的重量：上述兩組分充分混勻形成細(xì)胞凍存液,。實(shí)施例2臍帶血細(xì)胞的凍存采用實(shí)施例1所述細(xì)胞凍存液,，在凍存前24小時(shí)，將該凍存液置于2-8℃進(jìn)行溫度平衡,，以臍帶血細(xì)胞為例制備細(xì)胞懸液,，取800ul細(xì)胞懸液,，按按細(xì)胞懸液(v):細(xì)胞凍存液(v)＝4:1計(jì)算加入細(xì)胞凍存液的體積200ul，并以穩(wěn)定速率加入細(xì)懸液中,，這一過(guò)程需要在15min之內(nèi)完成,，同時(shí)需要不斷進(jìn)行混合，使得細(xì)胞凍存液能夠在細(xì)胞懸液中均勻分布,。隨后,，將充分混勻的細(xì)胞溶液分裝至，進(jìn)行程序性降溫至-80℃后轉(zhuǎn)至液氮中儲(chǔ)存,。從液氮系統(tǒng)中取出凍存的臍帶血細(xì)胞樣品,，等待1～2min使殘余液氮揮發(fā)之后，迅速放入37℃水浴中,，待可見(jiàn)冰塊剛好要消失至黃豆大小體積時(shí),，取出細(xì)胞樣品計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率結(jié)果如表1所示,。實(shí)施例3間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存采用實(shí)施例1所述細(xì)胞凍存液,，在凍存前24小時(shí)，將該凍存液置于2-8℃進(jìn)行溫度平衡,，以間充質(zhì)干細(xì)胞為例制備細(xì)胞懸液,，取800ul細(xì)胞懸液，按按細(xì)胞懸液(v):細(xì)胞凍存液(v)＝4:1計(jì)算加入細(xì)胞凍存液的體積200ul,，并以穩(wěn)定速率加入細(xì)懸液中,。浙江EKBIO Tech細(xì)胞凍存液保質(zhì)期南京做無(wú)血清細(xì)胞凍存液的公司哪家便宜。

    用吸管吸出細(xì)胞懸液,，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,，混勻；離心,，1000rpm,，5min；棄去上清液,，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度,，接種培養(yǎng)瓶,，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；次日更換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng),。注意事項(xiàng)：取錯(cuò)細(xì)胞：拿錯(cuò)凍存管。（快快快,，匆忙之中,，難免出錯(cuò),，況且－170多度，凍手?。┙鉀Q：（1）核查記錄冊(cè)及凍存管上細(xì)胞的名稱(chēng),、時(shí)間是否一致。（2）拿細(xì)胞時(shí)戴手套,！2.水浴時(shí)間太長(zhǎng)：2min還沒(méi)融化,。（凍存管的壁較厚，隔熱）解決：（1）適當(dāng)提高水浴溫度（37度－40度）,。（2）要是冬天,，就選用保溫盒。3.冰盒內(nèi)時(shí)間太長(zhǎng)：復(fù)蘇1h后,，還沒(méi)有加入新的培養(yǎng)液,。（高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶，凍存時(shí)保護(hù)細(xì)胞,，但復(fù)蘇融解后,，浸泡時(shí)間太久會(huì)，對(duì)細(xì)胞有毒性）解決：提前預(yù)定超凈臺(tái),，減少?gòu)?fù)蘇后插在冰盒里等待的時(shí)間,。4.失去耐心：復(fù)蘇三四天后，細(xì)胞沒(méi)有任何動(dòng)靜,，認(rèn)為失敗,，倒掉所有細(xì)胞。（有些細(xì)胞復(fù)蘇后一星期,，才有起色）解決：不要換液，耐心等待,，兩周后再做決定,。一、細(xì)胞凍存液1.無(wú)血清細(xì)胞凍存液產(chǎn)品概述:一種即用型,、無(wú)需程序降溫的細(xì)胞凍存液,適用于哺乳動(dòng)物低溫保存,。無(wú)需配制，使用簡(jiǎn)單,，細(xì)胞復(fù)活率高,。產(chǎn)品特點(diǎn)：(1)安全：無(wú)血清。

    DMSO),、甘油,、乙二醇、丙二醇,、甲醇,、乙醇,、丙醇、和甲酰胺等,。這類(lèi)保護(hù)劑能夠在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前,，穿過(guò)細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度,，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷。同時(shí),，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過(guò)分外滲,，避免了細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮。非滲透性冷凍保護(hù)劑一般是些大分子物質(zhì),，不能滲透到細(xì)胞內(nèi),。該類(lèi)保護(hù)劑主要包括聚yi烯吡ge烷酮、蔗糖,、聚乙二醇,、葡聚糖、白蛋白及***等,。其保護(hù)機(jī)制的假設(shè)很多,，其中一種可能是，聚yi烯吡ge烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中的水分子相結(jié)合,，降低溶液中自由水的含量,。使冰點(diǎn)降低。減少冰晶的形成,；同時(shí),，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低,，從而減輕溶質(zhì)損傷,。01細(xì)胞凍存的原理細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，也是保持細(xì)胞活性和增殖能力的重要手段,。細(xì)胞可以通過(guò)被暫時(shí)休眠（凍存）,，仿佛童話里的睡美人，留住年輕芳華,，等到需要時(shí)再被輕輕喚醒（復(fù)蘇）,。低溫下，活細(xì)胞中的生物和化學(xué)反應(yīng)都會(huì)極大降低,，為細(xì)胞長(zhǎng)期凍存提供了可能,。冷凍對(duì)大多數(shù)活生物體都是致命的，細(xì)胞凍存是利用冷凍保護(hù)劑來(lái)降低冰點(diǎn),，緩慢凍結(jié)細(xì)胞的過(guò)程中,，細(xì)胞內(nèi)水分透出細(xì)胞,。南京翌科生物科技有限公司無(wú)血清細(xì)胞凍存液比較靠譜。

    在細(xì)胞培養(yǎng)中,，細(xì)胞凍存是**關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,，尤其在細(xì)胞***、細(xì)胞存儲(chǔ)中對(duì)細(xì)胞凍存更有特殊要求,，下面就根據(jù)降溫速度以及凍存液組分對(duì)細(xì)胞凍存做詳細(xì)介紹,。根據(jù)降溫速度區(qū)分，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存,。根據(jù)凍存方式不同可以分為慢速凍存（程序降溫法）與快速凍存（非程序降溫法）,。程序降溫凍存技術(shù)要點(diǎn)是慢凍，標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2/℃min,；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),，可增至-5℃～-10℃/min。之前,，常用的傳統(tǒng)方法是將凍存管置于4℃30分鐘--->-20℃60分鐘--->-80℃過(guò)夜--->液氮罐,。不過(guò)，由于步驟較多,，間隔時(shí)間又長(zhǎng),，很容易遺忘。之后,，人們也開(kāi)始使用程序降溫盒,。將凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃冰箱,。以1℃/min的速度進(jìn)行降溫,。快速凍存即不需要經(jīng)過(guò)梯度降溫,，直接將細(xì)胞放入-80℃冰箱24h,，后轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期凍存?？焖賰龃婧?jiǎn)化了凍存步驟，同時(shí)不需要使用梯度凍存盒,。不同的凍存方法**了不同的凍存體系,，程序降溫法使用的凍存液主要配方為培養(yǎng)基、血清,、DMSO,。血清大多采用牛源，同時(shí)血清中未知成分和病毒等***物質(zhì)會(huì)給凍存帶來(lái)影響與風(fēng)險(xiǎn),，該方法科研上***使用,，并延續(xù)至今,。無(wú)血清細(xì)胞凍存液使用濃度怎么樣？常州專(zhuān)業(yè)做細(xì)胞凍存液可以放多久

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    傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液是使用培養(yǎng)基,、血清和DMSO按照一定的比例混合，其中DMSO的含量10%,，血清的含量是10%,，統(tǒng)稱(chēng)為含血清細(xì)胞凍存液。含血清細(xì)胞凍存液的一般的凍存方法是梯度降溫凍存法,，如先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘,，然后移至-20℃冰箱30分鐘，再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)（或隔夜）,，**后才移至液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期的儲(chǔ)存,。（其中需要注意的是-20℃條件下不可超過(guò)1個(gè)小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大,，造成細(xì)胞大量的死亡,。）可見(jiàn)，含血清細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞時(shí)遇到的問(wèn)題：1.凍存細(xì)胞時(shí)需現(xiàn)配凍存液(如購(gòu)買(mǎi)市面上通用的含血清細(xì)胞凍存液,，此步可省略)2.需要程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮）,，步驟繁瑣，耗時(shí)耗力3.含血清,，細(xì)胞污染(病毒,、霉菌和支原體等)的風(fēng)險(xiǎn)更高4.血清批次、品質(zhì)間差異導(dǎo)致凍存液的批次間差異5.需液氮凍存,，且不能原位（如孔板）凍存QuickFreezing-M是一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),、獨(dú)特配方的哺乳動(dòng)物細(xì)胞凍存液，其化學(xué)組成明確,，以DMEM為母液,，含有DMSO，不含牛血清或其他蛋白成分,。具有高效,、低毒、無(wú)外源因子和易于使用等優(yōu)點(diǎn),，推薦用于常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存,。QuickFreezing-M無(wú)血清細(xì)胞冷凍液的使用方法：1.用37℃水浴解凍細(xì)胞凍存液。常州原代細(xì)胞凍存液配方