貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長24h了，這個時間細胞已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時間對自己安排實驗時間也方便,。沒人愿意大半夜爬起來做實驗吧,。3,、加藥后的孵育時間,，我的實驗摸了3個時間,，24h,，48h,，72h,。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇比較好的時間,。太長了就沒有必要了,，細胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。4,、CCK8試劑加入量,，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系,，即細胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢,，還是細胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢,。關(guān)于這一點文獻報道不一致,。本人**終采用的是后者。5,、cck8試劑加入后孵育時間,，隨著時間的增加，OD值就會增大,?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h,、1.0h,、2.0h。**藥敏試驗：這個是用的比較廣的,，我見過做**的團隊,，買CCK-8都是一整箱，一整箱的買,。上海cck8測ic50算法

CCK-8的用途1.細胞增殖測定：細胞增殖實驗在很多領(lǐng)域都會用到,，比如**相關(guān)、損傷后修復(fù)等,。

2.***篩選：在測定一個***的毒性和安全有效濃度時,，經(jīng)常會用到CCK-8。

3.細胞毒性測定：這個可以和各個處理因素對細胞活性和增殖的影響,，比如在UV,、低氧或者什么化學(xué)物品對細胞的影響上,。

4.**藥敏試驗：這個是用的比較廣的，我見過做**的團隊,，買CCK-8都是一整箱,，一整箱的買，比如果子老師所在的團隊,，哈哈哈,。

5.微生物對細胞的毒性或增殖的實驗。 上海cck8注意事項CCK-8 反復(fù)凍融會增加背景值,，干擾實驗測定,。

用途：

***篩選、

細胞增殖測定,、

細胞毒性測定,、

**藥敏試驗等。

所需設(shè)備及儀器：

10ul,，100-200ul及多通道移液器

酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）

96孔培養(yǎng)板

二氧化碳培養(yǎng)箱

培養(yǎng)0.5-4小時:細胞種類不同,，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,，可以繼續(xù)培養(yǎng),，以確認比較好條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少,，需要較長的顯色時間（5-6小時）,。

測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm,，參比波長600-650nm,。

在做一些***毒性試驗時，比如做鐵死亡途徑時,，我們加入一個***叫C1,，這個時候就需要提前換液，其實我們試過,，還是會有一些影響,。所以這時我們用中性紅檢測。我們實驗室,，通常會用20%的硫酸銅溶液放到細胞孵箱下層,，預(yù)防******。理應(yīng)說,，硫酸銅分子在水溶液中是硫酸根離子和銅離子,，是不會揮發(fā)的。但是每次只要是新?lián)Q的硫酸銅溶液再做CCK-8,，結(jié)果總是不好,，我也不知道是什么原因,。之前在我們實驗室有發(fā)生過這樣的事情,，這種有深有淺的才是該有的結(jié)果,。我想說的是在有能力選擇范圍內(nèi)，盡量選擇好一點的試劑,，免得浪費時間,。無需放射性同位素和有機溶劑，對細胞毒性低.

特點不同1,、CellCountingKit-8：靈敏度高,，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好,；操作簡便,，省時省力；水溶性,，不需要換液,，尤其適合于懸浮細胞；無需放射性同位素和有機溶劑,，對細胞毒性低,；適合于高通量***篩選。2,、MTT法：特點是靈敏度高,、經(jīng)濟。三,、應(yīng)用不同1,、CellCountingKit-8：主要用途為***篩選、細胞增殖測定,、細胞毒性測定,、**藥敏試驗。2,、MTT法：***用于一些生物活性因子的活性檢測,、大規(guī)模的抗*****篩選、細胞毒性試驗以及**放射敏感性測定等,。細胞增殖與毒性檢測實驗方法及經(jīng)驗總結(jié)-CCK-8 法.上海cck8 缺點

在電子耦合試劑（也就是細胞是活的,，有呼吸，有能量代謝）.上海cck8測ic50算法

制作標(biāo)準曲線1.先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量,，然后接種細胞,。2.按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度,，每組3-6個復(fù)孔,。3.接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁,，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定O.D值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸),，O.D值為縱坐標(biāo)(Y軸)的標(biāo)準曲線,。根據(jù)此標(biāo)準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量(使用此標(biāo)準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時間),。上海cck8測ic50算法