在無菌條件下提取人體體液,，并用PBS緩沖液進行稀釋,，然后通過離心篩選初步去除體液中的細胞成分和細胞碎片，制成體液樣本備用；體液樣本純化：通過過濾膜對上述體液樣本進行過濾,，進一步去除體液中的細胞殘片及其他雜質,，靜置10～15分鐘,，留取沉淀物備用,；外泌體提取：將上述沉淀物用PBS緩沖液進行懸浮,，使外泌體懸浮于液體上層,，然后用無菌針管吸取上層含有外泌體的液體，置于80℃儲存?zhèn)溆?。此提取方法條件復雜,，成本高，專利申請利用靜置不太可能把外泌體沉降下來,；根據(jù)外泌體表面的特異生物化學特性通過提取試劑的特異配方把外泌體從水相中沉降下來,。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物,。外泌體提取色譜法是利用根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關系而對溶質進行分離的分析的方法。重慶正規(guī)外泌體提取試劑產(chǎn)品介紹

外泌體(exosomes,，Exos)是細胞分泌的一種膜囊泡,，因其可以將供體細胞的信息通過其攜帶的蛋白質、mRNA,、miRNA等傳遞到受體細胞,，實現(xiàn)細胞之間的信息交流及物質交換，并且可以作為藥物載體轉運藥物而引起科學家的普遍關注(Fig1),。外泌體作為內源性的天然藥物載體有著獨特的優(yōu)勢,，表面由脂質和蛋白質組成，使其可以穿透許多生物膜,，提高藥物的運輸效率和靶向性,，可以穩(wěn)定存在于血液中,，納米級尺寸明顯增強藥物在瘤部位的滲透滯留效應(permeabilityandretentioneffect,EPR)。目前,，許多抗藥物,、基因藥物及藥物均被成功載入外泌體。但是由于沒有較好的外泌體分離純化和載藥的方法,，使得其作為藥物載體的應用受到限制,。重慶正規(guī)外泌體提取試劑產(chǎn)品介紹嚴重阻礙了我國在外泌體的研究和臨床應用上的發(fā)展。

外泌體的提取分離：1,、PEG-base沉淀法,。聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，早先應用于從血清等樣本中收集病毒,，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體,，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低,，雜蛋白較多（假陽性）,，顆粒大小不均一，產(chǎn)生難以去除的聚合物,，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等,，因此發(fā)表文章時易受質疑。2,、試劑盒提取,。近幾年來，市場上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒,，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質成分,，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來,。這些試劑盒不需要特殊設備,，隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高,，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來,。有些試劑盒操作簡便，不用超速離心,，同時可獲得高純度和高回收率的外泌體,。

目前的主流觀點認為，外泌體的產(chǎn)生過程為：細胞膜內陷,，形成內體（endosome）,，再形成多泡體（multivesicularbodies，MVB）,，較后分泌到胞外成為外泌體,。外泌體中攜帶有母細胞的多種蛋白質,、脂類、DNA和RNA等重要信息,。外泌體較早見于1981年,，EGTrams等在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中發(fā)現(xiàn)了有膜結構的小囊泡，并命名為exosome,。對于外泌體的作用,，當時推測為細胞排泄廢物的一種方式。1996年GRaposo等發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細胞的免疫細胞也會分泌抗原呈遞外泌體（antigenpresentingvesicle）,，所分泌的外泌體可以直接刺激效應CD4+細胞的抗一些病癥反應,。2007年HValadi等進一步發(fā)現(xiàn)細胞之間可以通過外泌體中RNA交換遺傳物質。隨著有關外泌體研究越來越多,，研究者發(fā)現(xiàn)它普遍參與了機體免疫應答,、抗原呈遞、細胞分化,、一些病癥生長于侵襲等各種生物過程中,。目前人們多采用超速離心、免疫磁珠,、超濾,、沉淀或試劑盒等方法實現(xiàn)外泌體的提取分離。外泌體提?。撼叽缗抛枭V可以精確分離大小分子,。

外泌體的提取、分離方法：超高速離心法,。常用的是超高速離心法,，該方法是被譽為分離外泌體的“金標準”。該方法利用離心力從細胞培養(yǎng)液或生物流體獲得外泌體,，經(jīng)過400×g,、2000×g、10000×g的低速離心,，除去細胞及大的細胞分泌物,；較后超高速100000×g離心得到外泌體[12]。超高速離心因操作簡單,，不需要復雜的技術支持，并且成本相對較低而被普遍使用,。但是該方法耗時,、產(chǎn)率低，得到的外泌體的數(shù)量和質量很大程度上受轉子的類型,、轉子沉降角度等因素影響,，其中較主要的問題就是差速離心法獲得的沉淀物是外泌體,，但也會有其他的囊泡、蛋白質或蛋白和RNA的聚集體,。以提取尿液中的外泌體為例,，每次至少需要200毫升的尿液量。重慶正規(guī)外泌體提取試劑產(chǎn)品介紹

有關他們分泌和攝取及其組成,、“運載物”和相應功能的精確分子機制剛剛開始研究,。重慶正規(guī)外泌體提取試劑產(chǎn)品介紹

外泌體(Exosome)是由細胞分泌而來的微小囊泡，直徑約為30-200nm,，密度在1.13-1.21g/ml,，具有杯狀形態(tài)、雙層膜結構,，天然存在于血液,、尿液、唾液,、母乳和細胞培養(yǎng)基等生物體液中,。包括瘤細胞在內幾乎所有類型的細胞（免疫細胞、神經(jīng)細胞,、干細胞),，都可以產(chǎn)生并釋放exosome。Exosome內含有與細胞來源相關的蛋白質rRNA和microRNA,，Exosome可通過細胞膜受體直接受體細胞,，也可運輸?shù)鞍踪|、mRNA,、miRNA,、lncRNA、circRNA,，甚至細胞器進入受體細胞,，參與細胞間通訊。Exosome在免疫應答,、炎癥反應,、血管生成、凋亡,、凝血和廢物處理等生理過程發(fā)揮關鍵作用,，不同細胞來源的exosome所含有的RNA和蛋白成分不盡相同，可作為多種疾病的早期診斷標記物,，也能作為靶向藥物的載體進行疾病,。miRNA是一類22nt左右大小的非編碼分子，它可以通過外泌體從一個地方轉運到另外一個地方行使基因沉默功能。通過檢測外泌體中miRNA表達變化,，可以發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA特異性功能,。重慶正規(guī)外泌體提取試劑產(chǎn)品介紹