光學顯微鏡從1590年發(fā)明以來,，不斷發(fā)展，促進生命科學日新月異的發(fā)現(xiàn),，幫助人類逐層打開生命本質的大門,。同時，生命科學的發(fā)展不斷給光學顯微鏡提出新的要求,，促使成像理論和技術持續(xù)更新迭代,。科學進入21世紀,，人們已經不滿足于在體外研究細胞和組織,，需要能夠更真實地探索生命，在體內實時觀察細胞的發(fā)生和變化,。此時,，雙光子顯微鏡進入了科學家的視野。在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時，在波長為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時,，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中,。國外2PPLUS雙光子顯微鏡光刺激

雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡,。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質或是熒光染料,，使其發(fā)出熒光,。相比普通光學顯微鏡,，熒光顯微鏡運用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉,，提高了分辨力率,。而當被檢物體過厚時，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上,，使觀察到的像模糊,、發(fā)虛，無法清楚的知道被檢物體的結構,。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎上,，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題,。美國激光熒光雙光子顯微鏡作用雙光子顯微鏡使用方法是什么,？

利用鈣成像技術記錄大腦活動，隨著功能光學成像技術的發(fā)展,，神經學家們已經可以研究腦區(qū)和神經元內部的工作情況,。功能鈣成像技術就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內游離鈣離子濃度,，以此細胞的功能狀態(tài),。目前它被廣泛應用于實時監(jiān)測一群相關神經元內鈣離子的變化，從而判斷其功能活動,。該技術的出現(xiàn)使得科學家可以親眼目睹神經信號在神經網絡之中時間和空間上的傳遞穿梭,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢,？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來,，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點,、觀察！由于電磁波的波長越短,，粒子性越強,，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光,，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性,。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應,，所以掃描的精確度極高,，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質消耗。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。

后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7,、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況,，來驗證該光學系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性,。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間,，曝光間隔1s照射樣品,，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm,，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應的相應襯度圖,。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,，得到相應的(i)-(p)。由圖像可知,，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷,，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的,，所以預期細胞存活時間會更長,，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應用,。國外雙光子顯微鏡2PPLUS

雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡,。國外2PPLUS雙光子顯微鏡光刺激

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經過一個很短激發(fā)態(tài)后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。因其光損傷小,、樣本透射深等優(yōu)勢，使得觀察熒光細胞成為可能,。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的***成像研究,。以小鼠顱內***成像為優(yōu)勢，可動態(tài)**觀察小鼠顱內神經細胞,、小膠質細胞/巨噬細胞,、周細胞、血管,、轉移瘤細胞,、膠質瘤細胞等的變化情況,，在**學、神經生物學,、發(fā)育生物學,、神經退行性疾病等領域具有廣泛應用。小鼠其它組織臟器,，如脾、肺,、顱骨,、股骨、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究,。國外2PPLUS雙光子顯微鏡光刺激