雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先,，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡,。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質或是熒光染料,，使其發(fā)出熒光,。相比普通光學顯微鏡,，熒光顯微鏡運用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉,，提高了分辨力率,。而當被檢物體過厚時，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上,，使觀察到的像模糊,、發(fā)虛，無法清楚的知道被檢物體的結構,。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎上,，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題,。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源，激光束經照明孔,，經由分光鏡反射至物鏡,，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描,。組織樣品中的熒光物質受到刺激后發(fā)出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡,，通過探測孔時先聚焦，然后被光探頭收集,，轉化為信號輸送到計算機進行處理,。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準確,，同時通過改變物鏡的焦距,，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。雙光子顯微鏡是結合了雙光子技術和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,。國外布魯克雙光子顯微鏡成像視野

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源,，激光束經照明,，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上,，對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質受到刺激后發(fā)出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡,，通過探測***時先聚焦,，然后被光探頭收集，轉化為信號輸送到計算機進行處理,。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準確,，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進行掃描,，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。美國熒光激光雙光子顯微鏡價位雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經元成像,，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡,，其成像視場達到5毫米，能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像,。根據(jù)清華大學單一采購來源的**指導意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見一斑,。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程,，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像,。

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源，激光束經照明,，經由分光鏡反射至物鏡,，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描,。組織樣品中的熒光物質受到刺激后發(fā)出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡,，通過探測時先聚焦，然后被光探頭收集,，轉化為信號輸送到計算機進行處理,。這個裝置能讓通過探測的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準確,，同時通過改變物鏡的焦距,，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。而配合了雙光子激發(fā)技術,，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術,。由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長時間的研究,。2PPLUS雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點,、有生命體的觀察！國外布魯克雙光子顯微鏡成像視野

隨著技術的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造,。關于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡,，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本“透明度”提高,。國外布魯克雙光子顯微鏡成像視野