光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來,，不斷發(fā)展,，促進(jìn)生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn)，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門,。同時,，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代,?？茖W(xué)進(jìn)入21世紀(jì)，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細(xì)胞和組織,，需要能夠更真實(shí)地探索生命,，在體內(nèi)實(shí)時觀察細(xì)胞的發(fā)生和變化。此時，雙光子顯微鏡進(jìn)入了科學(xué)家的視野,。在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時,，在波長為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光,。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中,，該如何選擇以及更好的使用PMT。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡成像視野是多少

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高,。激光熒光雙光子顯微鏡價格雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝,。

使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實(shí)現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點(diǎn)陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光,，是通過物鏡匯聚的,。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。幾年前雙光子過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上,。即便如此,，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多，首先是便宜,，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配,，改動也靈活。好處就是可以鍛煉隊(duì)伍,，一趟走下來可以把新手帶出來,，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少,，首先是操心,，特別是第1次搭的時候，開始要想方案,，后來要解決各種實(shí)際問題,。其次是花時間，加上買配件的時間,，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol,，大多是老外寫的,，中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的時候,，容易走彎路，多花錢,，也多花時間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內(nèi)買這些東西耗時較長,。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn)，貼出來分享,，希望能幫到想自己動手的實(shí)驗(yàn)室,，雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的,；激光雙光子顯微鏡商家電話

優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強(qiáng)度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡成像視野是多少