雙光子顯微鏡為什么穿透能力強,？因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性，單光子激發(fā)的背景較強,，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性，單光子激發(fā)的背景較強,，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢上面的內(nèi)容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明,，在實際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料,，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,。investigator雙光子顯微鏡光子探測

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，被光探頭接收,，從而達到逐點掃描的效果。進口激光雙光子顯微鏡價格雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例,；

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像,，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯,。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達到5毫米,，能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像,。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見一斑,。

光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來，不斷發(fā)展,，促進生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn),，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門。同時,，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求,，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代?？茖W(xué)進入21世紀,，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細胞和組織，需要能夠更真實地探索生命,，在體內(nèi)實時觀察細胞的發(fā)生和變化,。此時，雙光子顯微鏡進入了科學(xué)家的視野,。在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時,，在波長為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光；而在雙光子激發(fā)時,，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光,。雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具,。國外熒光雙光子顯微鏡授權(quán)商

雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源,；investigator雙光子顯微鏡光子探測

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于，光學(xué)顯微鏡：用的是可見光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別,，在于一個基本的原理,，光的衍射。,。,。光波是一個有趣的東西，其中有一項,，如果物體的體積小于光的波長,，光一般可以繞過去，不發(fā)生明顯變化,。也就是說,，有這個物體和沒這個物體，在這種情況下,，光是不會發(fā)生明顯改變的,。可見光的波長（肉眼）：380～780納米,，也就是,，如果比380納米還要小的東西，用光學(xué)顯微鏡,，無論你放大多少倍,，也是看不見的。因為光繞過去了,。,。。光的衍射為了克服這個問題，科學(xué)家用波長更短的光去照射物體,，也是就被觀測物,。比如10納米級的光，這樣,，就能看到我們用肉眼無論如何都看不見的東西,。這就是電子顯微鏡多說一句，光速是不變的,。光速=頻率×波長,。波長越短，頻率越大,。,。頻率越大，光波的能量越大,。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大,，能看到的東西越小。顏色取決于物體能反射光的波長的長短當(dāng)你看到的物體小于較小可見光的波長,，那它就是沒有顏色的,。。,。因為顏色是肉眼對于可見光頻率在大腦中的投影,。。,。,。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎住?。,。沒有顏色不是透明的意思，它們不是肉眼可見顏色的定義中包含的,。investigator雙光子顯微鏡光子探測