多光子顯微鏡的前景巨大作為一個(gè)多學(xué)科交叉,、知識密集、資金密集的高技術(shù)產(chǎn)業(yè),，多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué),、生物學(xué)、化學(xué),、物理學(xué),、電子學(xué)、工程學(xué)等學(xué)科,，生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜,，進(jìn)入門檻較高，是衡量一個(gè)國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標(biāo)準(zhǔn)之一,。過去的5年,，多光子顯微鏡市場集中，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。顯微鏡作為一個(gè)傳統(tǒng)的高科技行業(yè),，其作用至今沒有被其他技術(shù)顛覆,，只是不斷融合并發(fā)展相關(guān)技術(shù)，在醫(yī)療和其他精密檢測領(lǐng)域發(fā)揮著更大的作用,。顯微鏡的商業(yè)化發(fā)展已進(jìn)入成熟期,，主要需求來自教學(xué)、生命科學(xué)的研究及精密檢測等,，全球市場呈現(xiàn)平緩的增長態(tài)勢,。然而，**,、,、顯微鏡產(chǎn)品（如多光子顯微鏡、電子顯微鏡）正拉動(dòng)市場需求,，多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮?。多光子顯微鏡市場集中,，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多,。模塊化多光子顯微鏡多光子激發(fā)

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用,、細(xì)胞的增殖,、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化,、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,，已經(jīng)對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入,、細(xì)致的研究，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí),、動(dòng)態(tài)監(jiān)測。在細(xì)胞的生理過程中,，基因,、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的,、動(dòng)態(tài)的變化,。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要,。因此,，發(fā)展能用于、動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí),、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法非常必要。熒光多光子顯微鏡配置證實(shí)了多光子顯微鏡對皮膚和別的皮膚病的診斷的可行性,。

ＳｔｅｒｎａｎｄＪｅａｎＭａｒｘ在評論中說：祖家能夠在更為精細(xì)的層次研究樹突的功能,，這在以前是完全不可能的。新的技術(shù)（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計(jì)算和神經(jīng)信號處理中的作用有了更好的理解,。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性,，及其獨(dú)特的電、及其獨(dú)特的電化學(xué)特征使神經(jīng)元完成了一系列的專門任務(wù),。雙光子與共聚焦在發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用雙光子∶每2.5分鐘掃描一次,，觀察24小時(shí),，發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次，觀察8小時(shí)后細(xì)胞分裂停止,，不能發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發(fā)時(shí)的細(xì)胞存活率為多光子系統(tǒng)的10～20%,。

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場（FOV）的神經(jīng)組織：使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元,，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn),，其原理是將具有一個(gè)射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上,，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射,。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對AOD,，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描,。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影,。目前,，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用,。多光子顯微鏡技術(shù)的優(yōu)勢如何,？又有哪些應(yīng)用？

對兩個(gè)遠(yuǎn)距離（相距大于1-2mm）的成像部位,，通常使用兩條單獨(dú)的路徑進(jìn)行成像,；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多光束進(jìn)行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題,，這個(gè)問題可以通過事后光源分離方法或時(shí)空復(fù)用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_,；時(shí)空復(fù)用方法指的是同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上延遲，這樣就可以暫時(shí)分離被不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號,。引入越多路光束就可以對越多的神經(jīng)元進(jìn)行成像,，但是多路光束會導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間的重疊增加，從而限制了區(qū)分信號源的能力,；并且多路復(fù)用對電子設(shè)備的工作速率有很高的要求,；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比，這會容易導(dǎo)致組織損傷。多光子顯微鏡中,，極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點(diǎn)上,，激發(fā)熒光團(tuán)產(chǎn)生圖像。美國多光子顯微鏡長時(shí)間觀察

多光子激光掃描顯微鏡是建立在激光掃描顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)方法,，三維觀察上提供更的光學(xué)切片能力,。模塊化多光子顯微鏡多光子激發(fā)

Ca2+是重要的第二信使，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有重要的作用,，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進(jìn)行觀測,，可以從某些方面對有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析，具有重要的意義,。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時(shí)間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。模塊化多光子顯微鏡多光子激發(fā)