雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高,，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，能夠更加安全,。雙光子顯微鏡的原理是什么？國外ultima雙光子顯微鏡圖像對比度

在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。進(jìn)口雙光子顯微鏡廠家電話雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點,、有生命體的觀察,！

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像,，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯,。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達(dá)到5毫米,，能夠跨多個腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像,。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來,，雙光子顯微鏡已成為較厚***生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見一斑。

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴(yán)重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴(yán)重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢上面的內(nèi)容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明,，在實際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大,，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像,；

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強,？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應(yīng)波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應(yīng)波長在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的,，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了,。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱，對可見光吸收強,。類似的,，平時用手電筒照射手指，會看到手通透紅亮,，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少,。2.生物組織對紅外光的散射弱。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方,。類似的,，早晨的太陽非常紅，也就是因為長波長的紅光穿透力更強,。這兩點共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強,。雙光子顯微鏡有哪些分類呢？國外ultima雙光子顯微鏡圖像對比度

雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像,。國外ultima雙光子顯微鏡圖像對比度

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于,，光學(xué)顯微鏡：用的是可見光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別，在于一個基本的原理,，光的衍射,。。,。光波是一個有趣的東西,，其中有一項，如果物體的體積小于光的波長,，光一般可以繞過去,，不發(fā)生明顯變化,。也就是說，有這個物體和沒這個物體,，在這種情況下,，光是不會發(fā)生明顯改變的?？梢姽獾牟ㄩL（肉眼）：380～780納米,，也就是，如果比380納米還要小的東西,，用光學(xué)顯微鏡,，無論你放大多少倍，也是看不見的,。因為光繞過去了,。。,。光的衍射為了克服這個問題,，科學(xué)家用波長更短的光去照射物體，也是就被觀測物,。比如10納米級的光,，這樣，就能看到我們用肉眼無論如何都看不見的東西,。這就是電子顯微鏡多說一句,，光速是不變的。光速=頻率×波長,。波長越短,，頻率越大。,。頻率越大,，光波的能量越大。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大,，能看到的東西越小,。顏色取決于物體能反射光的波長的長短當(dāng)你看到的物體小于較小可見光的波長,，那它就是沒有顏色的,。。,。因為顏色是肉眼對于可見光頻率在大腦中的投影,。。,。,。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎住！?。沒有顏色不是透明的意思,，它們不是肉眼可見顏色的定義中包含的。國外ultima雙光子顯微鏡圖像對比度