在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來(lái)的不利影響。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的,；進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡光子探測(cè)

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測(cè)量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹(shù)突鈣離子動(dòng)態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開(kāi)始完全凸顯,。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實(shí)驗(yàn)室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀顯微鏡,，其成像視場(chǎng)達(dá)到5毫米,，能夠跨多個(gè)腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購(gòu)來(lái)源的**指導(dǎo)意見(jiàn)：這種顯微鏡的視場(chǎng)是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來(lái),，雙光子顯微鏡已成為較厚***生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。下圖統(tǒng)計(jì)了自1990年以來(lái)每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量，發(fā)展速度可見(jiàn)一斑,。國(guó)外ultima雙光子顯微鏡廠家雙光子顯微鏡型號(hào)有哪些,？

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)？因?yàn)榻M織對(duì)可見(jiàn)光區(qū)域的較強(qiáng)吸收和散射帶來(lái)兩個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題第1個(gè)是激發(fā)光的減弱,，第2個(gè)就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強(qiáng)，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因?yàn)榻M織對(duì)可見(jiàn)光區(qū)域的較強(qiáng)吸收和散射帶來(lái)兩個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題第1個(gè)是激發(fā)光的減弱,，第2個(gè)就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強(qiáng)，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢(shì)上面的內(nèi)容基本在談到雙光子優(yōu)勢(shì)都會(huì)相對(duì)說(shuō)明,，在實(shí)際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大,，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料,，已經(jīng)有做到mm級(jí)別的穿透深度

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程,，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔,，提高了熒光檢測(cè)效率。

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng),？生物組織在近紅外波段存在兩個(gè)窗口,第1個(gè)近紅外窗口對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)在700nm-900nm,第2個(gè)近紅外窗口對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)在1000nm-1400nm之間。舉例說(shuō)明就是單晶硅對(duì)于可見(jiàn)光幾乎是不透明的,，但是對(duì)于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了,。原因有兩點(diǎn)：1.生物組織對(duì)紅外光的吸收弱，對(duì)可見(jiàn)光吸收強(qiáng),。類似的,，平時(shí)用手電筒照射手指，會(huì)看到手通透紅亮,，也是由于生物組織對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光吸收少,。2.生物組織對(duì)紅外光的散射弱。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長(zhǎng)λ的四次方,。類似的,，早晨的太陽(yáng)非常紅，也就是因?yàn)殚L(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光穿透力更強(qiáng),。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外光比可見(jiàn)光對(duì)生物組織的穿透能力強(qiáng),。這種雙光子顯微鏡的視場(chǎng)是普通顯微鏡的10倍,。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡光刺激

雙光子顯微鏡的應(yīng)用中，該如何選擇以及更好的使用PMT,。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡光子探測(cè)

通過(guò)對(duì)微型光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì),，F(xiàn)HIRM-TPM 2.0成像視野擴(kuò)大至420×420平方微米，微型物鏡的工作距離擴(kuò)展至1毫米,，以實(shí)現(xiàn)非侵入式成像,；嵌入了可拆卸的快速軸向掃描模塊，實(shí)現(xiàn)了180微米深度的三維體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像,。該模塊由一個(gè)快速的電動(dòng)變焦透鏡和一對(duì)中繼透鏡組成,，在不同深度成像時(shí)保持放大倍率恒定。其中,，變焦模塊重量1.8克,，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外,，新版微型化成像探頭還可整體即時(shí)拔插,，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物的干擾,。在重復(fù)裝卸探頭追蹤同一批神經(jīng)元時(shí),，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米,。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡光子探測(cè)