許多生物醫(yī)學(xué)成像方式,，無(wú)論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源,，并需要兼容的熒光染料,。熒光染料有自己的激發(fā)波長(zhǎng)，它們可以被單個(gè)光子以該激發(fā)波長(zhǎng)的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個(gè)幾乎同時(shí)到達(dá)的光子,，但每個(gè)光子的能量約為單光子能量的一半,，即雙波長(zhǎng)(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理,，后者是雙光子顯微鏡原理,。在對(duì)同一種熒光染料進(jìn)行成像時(shí)，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長(zhǎng),，因此雙光子的散射較小(波長(zhǎng)較長(zhǎng),，散射較小)，可以更深入地滲透到組織中,。雙光子顯微鏡知多少,。激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí),，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測(cè)效率。國(guó)外熒光雙光子顯微鏡用途雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無(wú)須使用孔限制光學(xué)散射,。

在傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡中,，來(lái)自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個(gè)樣品的重疊像，沒(méi)有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對(duì)樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進(jìn)行三維成像,、動(dòng)態(tài)成像等。然而,，***在濾除雜散光的同時(shí)也將大部分來(lái)自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達(dá)檢測(cè)器。若要提高信號(hào)強(qiáng)度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會(huì)導(dǎo)致對(duì)活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢(shì)來(lái)源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無(wú)須使用***限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢(shì)如下,。

Winfried Denk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100 fs脈寬,、630 nm可見(jiàn)光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，Chris Xu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類(lèi)大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被發(fā)動(dòng),，所以雙光子成像更清晰。

剛好雙光子在這兩點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢(shì)在實(shí)際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大,，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料,，已經(jīng)有做到mm級(jí)別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup雙光子顯微鏡的探測(cè)器,該怎么選用?investigator雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡大量運(yùn)營(yíng)在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中；激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對(duì)***細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究,；☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光,，可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對(duì)熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高；☆圖像對(duì)比度高：由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng),，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,，較大降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,，所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究,；激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少