多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度,，和較高的對比度在生物成像中有著重要的意義,，但是它通常需要較高的功率,。結(jié)合時(shí)間上展開的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但是其本身所利用的近紅外波段的光會導(dǎo)致分辨率較低,。清華大學(xué)陳宏偉教授和北京大學(xué)席鵬研究員合作研究,，結(jié)合了結(jié)構(gòu)光成像和上轉(zhuǎn)化粒子，開發(fā)了一種基于多光子上轉(zhuǎn)化材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM),。它可以實(shí)現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度,，并突破了衍射極限，實(shí)現(xiàn)了超分辨成像,。相較于普通的熒光顯微鏡,，該顯微鏡提升了，并且只需要較低的激發(fā)功率,。這種超快,、低功率、多光子的超分辨技術(shù),，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長遠(yuǎn)的應(yīng)用前景,。 多光子顯微鏡是衡量一個國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。嚙齒類多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

    基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像,，因此可用于拍攝不透明的厚樣品,。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似,，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長比共焦長,，能量較低，但穿透能力較強(qiáng),；2)雙光子顯微鏡沒有小孔,，提高了檢測效率；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高,。那么,，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢呢？原因是它采用雙光子激發(fā)方式,。使用波長較長的激發(fā)光子,，光子的能量較低，因此電子需要吸收兩個這樣的激發(fā)光子才能達(dá)到激發(fā)態(tài),，從而釋放出一個熒光光子,。因此，熒光信號的強(qiáng)度與光強(qiáng)的平方成正比,。因?yàn)榻裹c(diǎn)處的光強(qiáng)較大,，只能在焦點(diǎn)處激發(fā)熒光。波長越長,，穿透力越強(qiáng),，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡,。由于兩個光子只在焦點(diǎn)激發(fā)熒光，不需要小孔,，而是將所有的熒光都收集起來,，提高了檢測效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡,，利用三個激發(fā)光子可以實(shí)現(xiàn)更深的成像深度,。由于使用了更長的激發(fā)波長，穿透能力更強(qiáng),，成像深度更大,。此外，由于較強(qiáng)的非線性效應(yīng),，熒光信號的強(qiáng)度與光強(qiáng)的立方成正比,，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。 模塊化多光子顯微鏡技術(shù)多光子顯微鏡銷售渠道分析及建議,。

國內(nèi)顯微鏡制造市場目前斷層嚴(yán)重,。目前我國顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀，20年以上經(jīng)營積累的企業(yè)十分稀缺,，深度精密制造,、光學(xué)主要部件設(shè)計(jì)及工藝嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)升級。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡,、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司、尼康,、奧林巴斯等國外企業(yè),。國內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘,，切入顯微鏡市場,，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營將騰躍至一個更高的格局。未來國產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大,。目前中國使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司、尼康和奧林巴斯壟斷,。國內(nèi)有能力開始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少,，若國內(nèi)能夠制造出高性能、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡,，無異是會面臨極大的市場機(jī)遇。

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā),，光散射?。ㄐ×Ｗ拥纳⑸渑c波長的四次方的成反比）,。不需要***，能更多收集來自成像截面的散射光子,。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點(diǎn)區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減,，不易對深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點(diǎn)。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質(zhì)成像,。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測定的信噪比更高,。觀察活細(xì)胞∶離子測量（i.e.Ca2+）,，GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,，能對細(xì)胞長時(shí)間觀察,。全球多光子顯微鏡主要生產(chǎn)地區(qū)分析，包括產(chǎn)量,、產(chǎn)值份額等,。

針對雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn)，從理論上分析雙光子成像特點(diǎn),，并搭建一套時(shí)間,、空間分辨率高，能實(shí)時(shí),、動態(tài),、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶（1）能對不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測;（2）用特定染料對樣品標(biāo)記以后,，能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實(shí)驗(yàn)的研究,，改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下，簡化整個系統(tǒng),，使得實(shí)驗(yàn)操作方便,、安全。單光子激發(fā)熒光的過程,，就是熒光分子吸收一個光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級,。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢,。而在顯微成像中,，雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測的重要工具,。未來國產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大,。美國熒光多光子顯微鏡飛秒激光

證實(shí)了多光子顯微鏡對皮膚和別的皮膚病的診斷的可行性。嚙齒類多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能,，這兩個優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識。2019年,，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像,，這就要求MPM具有深層成像的能力,。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會帶來其他問題,，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光,。嚙齒類多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)