作為一個多學科交叉、知識密集,、資金密集的高技術(shù)產(chǎn)業(yè),，多光子顯微鏡涉及醫(yī)學、生物學,、化學,、物理學、電子學,、工程學等學科,，生產(chǎn)工藝相對復雜，進入門檻較高,，是衡量一個國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標準之一,。過去的5年，多光子顯微鏡市場集中,，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多,。顯微鏡作為一個傳統(tǒng)的高科技行業(yè)，其作用至今沒有被其他技術(shù)顛覆,，只是不斷融合并發(fā)展相關(guān)技術(shù),，在醫(yī)療和其他精密檢測領(lǐng)域發(fā)揮著更大的作用。顯微鏡的商業(yè)化發(fā)展已進入成熟期,，主要需求來自教學,、生命科學的研究及精密檢測等，全球市場呈現(xiàn)平緩的增長態(tài)勢,。然而,，顯微鏡產(chǎn)品（如多光子顯微鏡、電子顯微鏡）正拉動市場需求,，多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮?。從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場,。多光子顯微鏡層析成像

對于雙光子(2P)成像,，散焦和近表面熒光激發(fā)是兩個相對較大的深度限制因素，而對于三光子(3P)成像，這兩個問題**減少,。然而,，由于熒光團的吸收截面遠小于2P，三光子成像需要更高的脈沖能量才能獲得與2P相同激發(fā)強度的熒光信號,。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡要求更高,，后者需要更快的掃描速度以便及時采樣神經(jīng)元活動。為了在每個像素的停留時間內(nèi)收集足夠的信號,，需要更高的脈沖能量,。復雜的行為通常涉及大規(guī)模的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡，這些網(wǎng)絡既有本地連接,，也有遠程連接,。為了將神經(jīng)元的活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)測***分布的超大型神經(jīng)元的活動,。大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡將在幾十毫秒內(nèi)處理輸入的刺激,。為了理解這種快速神經(jīng)元動力學，MPM需要快速成像神經(jīng)元的能力,?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。美國模塊化多光子顯微鏡成像精度雙光子共聚焦顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡具有更亮的橫向分辨率和縱向分辨率,。

多光子顯微鏡通過引入具有超高透射率,、非常陡峭的邊緣和精心優(yōu)化的阻擋的濾光片，為多光子用戶帶來了增強的性能,?？紤]到激發(fā)激光器和多光子成像系統(tǒng)的其他復雜元件通常需要多少投資，這些新的光學濾光片**了一種簡單且廉價的升級,，可以顯著提高系統(tǒng)性能,。事實上，與傳統(tǒng)濾光片的褐**調(diào)相比,，發(fā)射濾光片看起來像窗戶玻璃一樣清晰,，而且LWP二向色鏡具有如此寬的反射帶，它們看起來像高反射鏡,。發(fā)射濾光片還在Ti:Sapphire激光調(diào)諧范圍內(nèi)提供深度阻擋,，這對于實現(xiàn)高信噪比和測量靈敏度至關(guān)重要。

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式,，使用振鏡進行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換,，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示,。在LSU模塊中,，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動以進行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡,。多光子顯微鏡銷售/營銷策略建議,。

多光子激發(fā)的特點。激發(fā)波長∶兩個或多個光子同時激發(fā),，激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）,。多光子激發(fā)∶依賴于多個光子同時到達的時間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16seconds）,，且能提供更高的峰值功率,。熒光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產(chǎn)生多光子吸收,。熒光強度正比于（激光強度）n,。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實現(xiàn)三光子激發(fā),。深度成像需要更高,、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū),，對細胞毒性和光漂白更小。多光子顯微鏡的分辨率比傳統(tǒng)的單光子共聚焦要低的多,。激光掃描多光子顯微鏡暗場成像

從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。多光子顯微鏡層析成像

隨著生物分子光學標記技術(shù)的不斷進步,，光學技術(shù)在揭示生命活動基本規(guī)律的研究中正發(fā)揮越來越重要的作用,，也為醫(yī)學診療提供了更多、更有效的手段,。生物醫(yī)學光學是近年來受到國際光學界和生物醫(yī)學界關(guān)注的研究熱點,，在生物活檢,、光動力、細胞結(jié)構(gòu)與功能檢測,、基因表達規(guī)律的在體研究等問題上取得了一系列研究成果,，目前正在從宏觀到微觀上對大腦活動與功能進行多層面的研究。細胞重大生命活動（包括細胞增殖,、分化,、凋亡及信號轉(zhuǎn)導）的發(fā)生和調(diào)節(jié)是通過生物大分子間（如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸等）相互作用來實現(xiàn)的,。蛋白質(zhì)作為基因調(diào)控的產(chǎn)物,，與細胞和機體生理過程代謝直接相關(guān)，深入研究基因表達及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用不僅能揭示生命活動的基本規(guī)律,，同時也能深入了解疾病發(fā)生的分子機理,，進而為尋找更有效的藥物分子、提高藥物篩選和藥物設計的效率提供新的方法和思路,。多光子顯微鏡層析成像