雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測效率,。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。熒光雙光子顯微鏡授權(quán)公司雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司,；

研究人員通過用不同激光波長并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing）,，增加了相同時間內(nèi)可以成像的體積，并同時保持較高的時間和空間分辨率,。通過引入兩種波長不同的鈣信號熒光探針,，研究人員將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩個不同顏色，并同時用兩個不同波長的激光激發(fā)探針,，實現(xiàn)了兩個顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄,。為了實現(xiàn)三維空間成像，研究人員還分別在兩個激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng),，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）,。由此，可以同時以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個平面,，覆蓋縱深達600微米,，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達到2000個以上,。

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡 FHIRM-TPM 2.0,，其成像視野是該團隊于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍，同時具備三維成像能力,，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像,，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達一個月的追蹤記錄。在一批“早鳥項目”中,，該系統(tǒng)已被多個研究組應(yīng)用于不同的模式動物和行為范式,，如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化,、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項研究,。雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。

系統(tǒng)示意圖如圖1所示,，紅外激光束從藍寶石激光器出射后,，由一個光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200 fs, 重復(fù)頻率80 MHz,，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中,，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束,。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號,。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤,，產(chǎn)生共焦效應(yīng)，隔離來自焦平面外的雜散光,。雙光子顯微鏡中,，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測,，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。美國熒光雙光子顯微鏡成像原理是什么

雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源,。2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野

美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合,，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差,，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強度,，明顯改進了成像質(zhì)量，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細(xì)節(jié)變得清晰可見,，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像,。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實,。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》,。2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野

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