細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長,，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),，反而會(huì)減弱,，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中,，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義,。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等等,，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的變化,。多光子激光掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質(zhì)的層析成像問題, 擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。美國清醒動(dòng)物多光子顯微鏡技術(shù)

我們要指出的是,，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的,。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu),，其目的是為了,，通過共焦結(jié)構(gòu)，提高整個(gè)熒光顯微鏡的空間分辨率,。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同,，實(shí)現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像,。往往一個(gè)普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡(jiǎn)化整個(gè)系統(tǒng),，相對(duì)來說,，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測(cè)效率,，這個(gè)也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu),，分辨率則會(huì)更高,，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。飛秒激光多光子顯微鏡層析成像從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描,，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段,，如圖2所示。在LSU模塊中,，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來擴(kuò)大FOV,，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)需要依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡,。

Ca2+是重要的第二信使,，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有極其重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對(duì)Ca2+熒光信號(hào)進(jìn)行觀測(cè),，可以從某些方面對(duì)有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析，具有重要的意義,。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時(shí)間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對(duì)單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差,。多光子成像是一種非線性的過程,，信號(hào)產(chǎn)生要求功率密度達(dá)到MW/cm2的量級(jí),。

有許多方法可以實(shí)現(xiàn)快速光柵掃描，例如使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,，以及將振鏡與可調(diào)電動(dòng)透鏡相結(jié)合進(jìn)行快速3D掃描,。而可調(diào)電動(dòng)式鏡頭由于機(jī)械慣性的限制,，無法在軸向快速切換焦點(diǎn),，影響成像速度。現(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代,。遠(yuǎn)程對(duì)焦也是實(shí)現(xiàn)3D成像的一種手段,，如圖2所示。LSU模塊中,，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)整M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來放大FOV。然而,，大NA和大FOV的物鏡通常很重,，不能快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)中,。Ultima 2P Plus多光子顯微鏡設(shè)備

多光子顯微鏡市場(chǎng)集中,，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。美國清醒動(dòng)物多光子顯微鏡技術(shù)

    多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展,，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本,，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為,，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)64.44%的市場(chǎng)份額,，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向,。目前世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場(chǎng)這方面的需求增長更快,，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＣ绹逍褎?dòng)物多光子顯微鏡技術(shù)

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