多光子顯微鏡成像深度深、對比度高,，在生物成像中具有重要意義,，但通常需要較高的功率。結(jié)合時間傳播的超短脈沖可以實現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度,，但近紅外波段的光本身會導致分辨率較低,。基于多光子上轉(zhuǎn)換材料和時間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)是由清華大學教授和北京大學彭研究員合作開發(fā)的,?？蓪崿F(xiàn)50MHz的超高掃描速度，突破衍射極限,，實現(xiàn)超分辨率成像,。與普通熒光顯微鏡相比，該顯微鏡經(jīng)過改進,，只需要較低的激發(fā)功率,。這種超快、低功耗,、多光子超分辨率技術(shù)在高分辨率生物深層組織成像中具有長遠的應用前景。多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中,。還有其他類型的圖像對比提供有關(guān)樣本的有價值信息,。美國熒光多光子顯微鏡多光子激發(fā)

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進行快速3D掃描,，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換,，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段,。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差,，還可以進行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV,，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦,、SLM和可調(diào)電動透鏡,。多光子顯微鏡成像精度多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復雜結(jié)構(gòu),。

繼首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后,，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力,，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個神經(jīng)元進行成像,，實現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個月追蹤記錄。通過對微光學系統(tǒng)的重新設計系統(tǒng)的,。微物鏡工作距離延長至1mm,，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊,，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實時成像,。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定,。其變焦模塊重量,，研究人員可根據(jù)實驗需求自由拆卸。此外,，新版微型化成像探頭可整體即時拔插,，極大地簡化了實驗操作，避免了長周期實驗時對動物的干擾,。在重復裝卸探頭同一批神經(jīng)元時,，視場旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米。

多光子激光掃描顯微鏡的產(chǎn)業(yè)發(fā)展,，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要分布在德國和日本,，德國以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為基礎，日本以尼康和奧林巴斯為基礎,。2020年以來,，這些企業(yè)占據(jù)了全球多光子激光掃描顯微鏡市場的64.44%，它們的發(fā)展策略影響著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向,。目前,，世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求正在增長，中國市場的需求增長更快,。未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將仍有巨大的發(fā)展?jié)摿?。國?nèi)市場多光子顯微鏡銷售渠道。

    對于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號,。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描,，以便及時采樣神經(jīng)元活動,；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號,。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡,，該網(wǎng)絡既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來,，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動,，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學,，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力,。快速MPM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。 多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率,。美國bruker多光子顯微鏡單分子成像定位

多光子顯微鏡的大多數(shù)補償器都采用棱鏡。美國熒光多光子顯微鏡多光子激發(fā)

對于兩個遠距離(相距1-2mm以上)的成像部位,，通常采用兩個**的路徑進行成像,；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個物鏡的多個光束進行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串擾,，這可以通過事后光源分離或時空復用來解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串擾的算法,；時空復用法是指同時使用多個激發(fā)光束,，每個光束的脈沖在時間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個熒光信號可以暫時分離,。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會導致熒光衰減時間重疊增加,，從而限制了分辨信號源的能力,；并且復用對電子設備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比,，這樣容易導致組織損傷,。美國熒光多光子顯微鏡多光子激發(fā)

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