要想實現(xiàn)離散的軸向重新聚焦,，需要在OBJ1的焦平面中放置一個階梯鏡（圖3b）,。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時，被反射的激光將在無窮大的空間中成為準(zhǔn)直光束,，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑,。并且返回的激光束會被GSM消除橫向掃描，即OBJ2形成的焦點不會進(jìn)行橫向掃描,，實現(xiàn)軸向掃描,。如果激光點被掃描到與焦平面不一致的階梯，則會形成遠(yuǎn)離鏡面的激光焦點,，返回的激光束會在無窮大的空間中會聚或發(fā)散,，進(jìn)而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點也在軸向重新聚焦，通過這種方式即能實現(xiàn)離散的軸向掃描,。對于已精確匹配兩個物鏡光瞳的光學(xué)裝置,，不會引入像差。為了進(jìn)行連續(xù)的軸向重新聚焦,，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡,，同時入射的激光焦點也需要被傾斜，使得其以垂直于鏡面的方向入射,，通過相對入射激光束稍微平移OBJ1即可實現(xiàn)這種傾斜,。多光子顯微鏡在臨床前評價IA形態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì),、細(xì)胞密度和血管形成等方面顯示出強大的作用,。美國進(jìn)口多光子顯微鏡三維分辨率

    繼首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡,。它具有更大的成像視野和三維成像能力,，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個神經(jīng)元進(jìn)行成像，實現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個月追蹤記錄,。通過對微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計系統(tǒng)的,。微物鏡工作距離延長至1mm,，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊,，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實時成像,。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定,。其變焦模塊重量,，研究人員可根據(jù)實驗需求自由拆卸。此外,，新版微型化成像探頭可整體即時拔插,，極大地簡化了實驗操作，避免了長周期實驗時對動物的干擾,。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時,，視場旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米,。 美國嚙齒類多光子顯微鏡原理多光子顯微鏡可以更好的了解神經(jīng)信號之間復(fù)雜動態(tài)的編碼過程,。

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率,。

通過添加FACED模塊,，可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng)。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描,，需要很少的計算處理,，在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用，并且不受串?dāng)_的影響,，而且對整個圖像平面采樣后可以進(jìn)行運動校正,。實驗中沒有觀察到光損傷的跡象,，此外，子脈沖延遲到達(dá)相同的樣品位置,，能為熒光團(tuán)提供充足的時間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài),，可以明顯減少光漂白。使用現(xiàn)有的傳感器,，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來檢測神經(jīng)元過程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變,，以及來自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡,，在小鼠大腦中實現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動成像,。在物鏡平均激光功率為10-85mW下，他們測量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動,。顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡,。

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描,，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點切換，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示,。在LSU模塊中,，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡,。多光子顯微鏡是衡量一個國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標(biāo)準(zhǔn)之一,。美國布魯克多光子顯微鏡成像深度

多光子激光掃描顯微鏡是建立在激光掃描顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上的實驗方法，三維觀察上提供更的光學(xué)切片能力,。美國進(jìn)口多光子顯微鏡三維分辨率

細(xì)胞在受到外界刺激時,，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強,，反而會減弱,，直至恢復(fù)到未加刺激物時的水平。對于細(xì)胞受精過程中 Ca2+熒光信號的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn),，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時,，Ca2+熒光信號強度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象,，對研究受精發(fā)育的早期信號及 Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂,、胞吐作用等,，Ca2+熒光信號強度也會發(fā)生很的變化。美國進(jìn)口多光子顯微鏡三維分辨率