因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測效率,。與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有更好的深度穿透能力和較低光損傷性,，可以觀察更深層的組織結(jié)構(gòu),。熒光多光子顯微鏡原理

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步，特別是隨著后基因組時代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用,、細(xì)胞的增殖,、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化,、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,，已經(jīng)對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入,、細(xì)致的研究，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實(shí)時,、動態(tài)監(jiān)測,。在細(xì)胞的生理過程中，基因,、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化,。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲取這些信息對與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此,，發(fā)展能用于,、動態(tài)、實(shí)時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常必要的,。美國全自動多光子顯微鏡光子顯微鏡可以觀察生物細(xì)胞,、組織、微生物,、纖維等樣品,，具有分辨率高、成像速度快,、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),。

光學(xué)成像技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學(xué)問題提供了條件與可能。因此,，在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，急需發(fā)展新的成像技術(shù),。在動物體內(nèi),，如何實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)之間相五作用的實(shí)時在體成像監(jiān)測是當(dāng)前迫切需要解決的重大科學(xué)技術(shù)問題。這是也生物學(xué),、信息科學(xué)（光學(xué)）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科共同感興趣的重大問題,。對這-一一科學(xué)問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律,、認(rèn)識疾病的發(fā)展規(guī)律,，而且對創(chuàng)新藥物研究,、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)等產(chǎn)生重大影響,。

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描,，但可調(diào)電動透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換,，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段。在LSU模塊中,，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動透鏡。由于光的波長有限,，光子顯微鏡的分辨率受到限制,，無法觀察到更小的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器,。

我們要指出的是,，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的,。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu),，其目的是為了,，通過共焦結(jié)構(gòu),，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同，實(shí)現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像,。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平,。這樣就可以簡化整個系統(tǒng),，相對來說,，就提高了激發(fā)光源的利用率,，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一,。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu),，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的,。多光子顯微鏡,，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、實(shí)時,、動態(tài)的生物組織觀測,。熒光多光子顯微鏡原理

利用多光子顯微鏡，進(jìn)行無損,、高分辨率的生物組織層析成像,。熒光多光子顯微鏡原理

有許多方法可以實(shí)現(xiàn)快速光柵掃描,，例如使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，以及將振鏡與可調(diào)電動透鏡相結(jié)合進(jìn)行快速3D掃描,。而可調(diào)電動式鏡頭由于機(jī)械慣性的限制,，無法在軸向快速切換焦點(diǎn)，影響成像速度?，F(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代,。遠(yuǎn)程對焦也是實(shí)現(xiàn)3D成像的一種手段,，如圖2所示,。LSU模塊中,，掃描振鏡水平掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)整M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速軸向掃描,。為了獲得更多的神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來放大FOV,。然而,，大NA和大FOV的物鏡通常很重,，不能快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描,，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動透鏡,。熒光多光子顯微鏡原理