Ca2+是重要的第二信使，對于調節(jié)細胞的生理反應具有極其重要的作用,，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術對Ca2+熒光信號進行觀測,，可以從某些方面對有機體或細胞的變化機制進行分析，具有重要的意義,。利用雙光子熒光顯微成像技術可以觀察細胞內用熒光探針標記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+不僅在細胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細胞內各局部區(qū)域的不同深度或層次間也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。實現(xiàn)細胞內分子級觀測,，多光子顯微鏡開啟生命科學新篇章,。美國進口多光子顯微鏡多光子激發(fā)

現(xiàn)代分子生物學技術的迅速發(fā)展和科技的進步，特別是隨著后基因組時代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞模型,，為在體研究基因表達規(guī)律、分子間的相互作用,、細胞的增殖,、細胞信號轉導、誘導分化,、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學條件,。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學方法,，已經(jīng)對基因表達和蛋白質之間的相互作用進行了深入,、細致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質和基因活動的實時,、動態(tài)監(jiān)測,。在細胞的生理過程中，基因,、尤其是蛋白質的表達,、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化,。目前的分子生物學方法還不能捕獲到蛋白質和基因的這些變化,，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質之間的相互作用又至關重要。因此,，發(fā)展能用于,、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質和基因活動的方法是非常有必要的,。進口多光子顯微鏡原理滔博生物-三維顯微鏡-適用于各行各業(yè)的觀察需求!

比較兩表格中的相關參數(shù)可以看出，基于分子光學標記的成像技術已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢,。例如,，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm,，時間分辨率;分鐘量級,。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數(shù),，請參見表1-1）,，且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米,。因此,，二者相比，雖然光學成像在測量深度方面不及PET,，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢,。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學成像技術可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像,。例如,，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術可望實現(xiàn)小鼠體內基因表達的實時在體成像,。

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點:a.光損傷小:雙光子熒光顯微以可見光或近紅外光為激發(fā)光,，對細胞和組織的光損傷小，適合長期研究,；b.穿透力強:與紫外光,、可見光或近紅外光相比，穿透力強,，可用于生物樣品的深入研究,；c.高分辨率:由于雙光子吸收截面很小P，熒光只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā),，雙光子吸收被限制在焦點λ左右的體積內,；d.漂白區(qū)域很小，焦點外不發(fā)生漂白,。E.高熒光收集率與共焦成像相比,，雙光子成像不需要濾光片，提高了熒光收集率,。采集效率的提高直接導致圖像對比度的提高,。F.對探測光路要求低。由于激發(fā)光和發(fā)射熒光的波長差越來越大，加上自發(fā)三維濾波效應,，多光子顯微鏡對光路采集系統(tǒng)的要求遠低于單光子共焦顯微鏡,，光學系統(tǒng)也相對簡單。G.適用于多標簽復合測量許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)光譜更寬,，從而可以用單一波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種染料,，獲得同一生命現(xiàn)象的不同信息，便于相互比較和補充,。更多關于多光子顯微鏡的信息有哪些,？

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā)，光散射?。ㄐ×Ｗ拥纳⑸渑c波長的四次方的成反比）,。不需要***，能更多收集來自成像截面的散射光子,。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減,，不易對深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質成像,。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測定的信噪比更高,。觀察活細胞∶離子測量（i.e.Ca2+）,，GFP，發(fā)育生物學等—減少了光毒性和光漂白,，能對細胞長時間觀察,。高精度，低光損,，多光子顯微鏡為科研提供準確依據(jù),。進口多光子顯微鏡原理

高速掃描，高分辨率,，多光子顯微鏡助力科研進步,。美國進口多光子顯微鏡多光子激發(fā)

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