多光子顯微鏡成像深度深、對(duì)比度高,，在生物成像中具有重要意義,，但通常需要較高的功率。結(jié)合時(shí)間傳播的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度,，但近紅外波段的光本身會(huì)導(dǎo)致分辨率較低,。基于多光子上轉(zhuǎn)換材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)是由清華大學(xué)教授和北京大學(xué)彭研究員合作開(kāi)發(fā)的,?？蓪?shí)現(xiàn)50MHz的超高掃描速度,，突破衍射極限，實(shí)現(xiàn)超分辨率成像,。與普通熒光顯微鏡相比,，該顯微鏡經(jīng)過(guò)改進(jìn)，只需要較低的激發(fā)功率,。這種超快,、低功耗、多光子超分辨率技術(shù)在高分辨率生物深層組織成像中具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的應(yīng)用前景,。多光子顯微鏡是一種高分辨率的顯微鏡技術(shù),，利用多光子激發(fā)熒光的原理來(lái)觀察生物樣品的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。美國(guó)進(jìn)口多光子顯微鏡成像深度

有許多方法可以實(shí)現(xiàn)快速光柵掃描,，例如使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,，以及將振鏡與可調(diào)電動(dòng)透鏡相結(jié)合進(jìn)行快速3D掃描。而可調(diào)電動(dòng)式鏡頭由于機(jī)械慣性的限制,，無(wú)法在軸向快速切換焦點(diǎn),，影響成像速度。現(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代,。遠(yuǎn)程對(duì)焦也是實(shí)現(xiàn)3D成像的一種手段,，如圖2所示。LSU模塊中,，掃描振鏡水平掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過(guò)調(diào)整M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速軸向掃描,。為了獲得更多的神經(jīng)元成像，可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)放大FOV,。然而,，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描,，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。美國(guó)多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位滔博生物多光子顯微鏡具有出色的成像深度和分辨率!

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2],。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度,。近年來(lái),，通過(guò)使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描。但遠(yuǎn)程對(duì)焦時(shí)對(duì)反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度，ETL會(huì)引入球差和高階像差,，無(wú)法進(jìn)行高分辨率成像,。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計(jì),，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無(wú)球面像差的軸向掃描,，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計(jì),。***個(gè)可以執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一個(gè)可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示,，特定裝置由兩個(gè)垂直臂組成,，每個(gè)臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成,，另一個(gè)臂(稱為照明臂)由浸沒(méi)物鏡(OBJ2)組成,。兩個(gè)臂對(duì)齊，使得GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂,，由GSM進(jìn)行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)可以進(jìn)行水平掃描,。

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式,，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描,，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無(wú)法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換,，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段,，如圖2所示。在LSU模塊中,，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過(guò)調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無(wú)法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)需要依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。精確測(cè)量細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能,，多光子顯微鏡技術(shù)走在科技前沿,。

對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像,；對(duì)于相鄰區(qū)域,，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_,，這可以通過(guò)事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲,，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多,，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力,；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高,；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷,。光子顯微鏡可以觀察生物細(xì)胞,、組織、微生物,、纖維等樣品,，具有分辨率高、成像速度快,、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),。激光掃描多光子顯微鏡原理

突破光學(xué)成像技術(shù)的限制，多光子顯微鏡為科研工作提供新思路,。美國(guó)進(jìn)口多光子顯微鏡成像深度

根據(jù)阿貝成像原理,，許多光學(xué)成像系統(tǒng)是一個(gè)低通濾波器，物平面包含從低頻到高頻的信息,，透鏡口徑會(huì)限制高頻信息通過(guò),，只允許一定的低頻通過(guò)，因此丟失了高頻信息會(huì)使成像所得圖像的細(xì)節(jié)變模糊,，降低分辨率,。對(duì)于三維成像來(lái)說(shuō)，寬場(chǎng)照明時(shí)得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息,，同時(shí)還包含焦平面外的樣品信息,。由于受到焦平面外的信息干擾,，常規(guī)熒光顯微鏡無(wú)法獲得層析圖像。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率,、獲得層析圖像,，是因?yàn)槔锰囟ńY(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息，當(dāng)結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時(shí),，只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制,，超出這一區(qū)域，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰?，也就是只有焦面附近的有限區(qū)域具有相對(duì)完整的頻譜信息,，離焦后，高頻信息迅速衰減,，所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來(lái)獲得層析圖像,。然后再通過(guò)軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像，重建樣品的三維結(jié)構(gòu),。美國(guó)進(jìn)口多光子顯微鏡成像深度