使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號,，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要明顯提高2PM的成像速率,。利用多光子顯微鏡的光遺傳學(xué)操作能力，我們可以對某類神經(jīng)元的ji活和失活進(jìn)行高精度的操作,。美國多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

    多光子顯微優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收*局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器,，這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究；☆避免組織自發(fā)熒光的干擾,，獲得較強(qiáng)的樣品熒光：生物組織中的自發(fā)熒光物質(zhì)的激發(fā)波長一般在350~560nm范圍內(nèi),，采用近紅外或紅外波段的激光作為光源，能**降低生物組織對激發(fā)光吸收,。 高速高分辨率多光子顯微鏡Ultima InvestigatorOCT可以用于損傷修復(fù)監(jiān)測,。Yeh等用OCT、多光子顯微鏡,。

光學(xué)成像技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學(xué)問題提供了條件與可能,。因此，在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上,，急需發(fā)展新的成像技術(shù),。在動物體內(nèi)，如何實現(xiàn)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)之間相五作用的實時在體成像監(jiān)測是當(dāng)前迫切需要解決的重大科學(xué)技術(shù)問題,。這是也生物學(xué),、信息科學(xué)（光學(xué)）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科共同感興趣的重大問題。對這-一一科學(xué)問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律,、認(rèn)識疾病的發(fā)展規(guī)律,，而且對創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)等產(chǎn)生重大影響,。

細(xì)胞在受到外界刺激時,，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強(qiáng),，反而會減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時的水平,。對于細(xì)胞受精過程中 Ca2+熒光信號的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時,，Ca2+熒光信號強(qiáng)度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象,，對研究受精發(fā)育的早期信號及 Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂,、胞吐作用等,，Ca2+熒光信號強(qiáng)度也會發(fā)生很的變化。多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué),、生物學(xué),、化學(xué)、物理學(xué),、電子學(xué),、工程學(xué)等學(xué)科，生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜,，進(jìn)入門檻較高,。

根據(jù)阿貝成像原理，許多光學(xué)成像系統(tǒng)是一個低通濾波器,，物平面包含從低頻到高頻的信息,，透鏡口徑會限制高頻信息通過，只允許一定的低頻通過,，因此丟失了高頻信息會使成像所得圖像的細(xì)節(jié)變模糊,，降低分辨率。對于三維成像來說,，寬場照明時得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息,，同時還包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息干擾,，常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像,。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率、獲得層析圖像,，是因為利用特定結(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息,，當(dāng)結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時，只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制,，超出這一區(qū)域,，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰鳎簿褪侵挥薪姑娓浇挠邢迏^(qū)域具有相對完整的頻譜信息,，離焦后,，高頻信息迅速衰減,，所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來獲得層析圖像。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像,，重建樣品的三維結(jié)構(gòu),。顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡。布魯克多光子顯微鏡成像分辨率

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。美國多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展,，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為,，而日本以尼康和奧林巴斯公司為,，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額,，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向,。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快,，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＣ绹喙庾语@微鏡準(zhǔn)確定位