有了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡可以發(fā)揮更好的作用,。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，使電子躍遷到更高的能級。短時間后,，電子跳回到較低的能級,，發(fā)出波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理,，雙光子激發(fā)技術(shù)誕生了,。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光通過物鏡會聚。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，物鏡焦點(diǎn)處的光子密度比較高,，所以雙光子激發(fā)只能發(fā)生在焦點(diǎn)處產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光穿過物鏡,，被光學(xué)探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。在深度組織中以較長時間對細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。國外熒光激光雙光子顯微鏡光刺激

    細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細(xì)胞興奮時,，產(chǎn)生了一個電沖動,，此時，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi),，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動,。以此類推,，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系,，終形成學(xué)習(xí),、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性,。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。 進(jìn)口bruker雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。

從雙光子的原理和特點(diǎn),，我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，因此該波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷很小,，適合長期研究,；☆穿透能力強(qiáng):與紫外光相比，可見光和近紅外光的穿透能力更強(qiáng),，因此受生物組織散射的影響更小,，解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問題；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小,，只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光,，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)處體積約為波長三次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,，焦點(diǎn)外的區(qū)域不會發(fā)生光漂白,；☆熒光收集率高:與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片(共焦),，提高了熒光收集率,，直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,，瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16,，減少了散射的干擾；光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇性激發(fā),，因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像,；

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理,。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本的“透明度”提高。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學(xué)散射,。

2020年,，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告,。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺潘琳老師主持,。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士、碩士學(xué)位,，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。雙光子顯微鏡除了可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行成像,。國外雙光子顯微鏡成像原理是什么

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其實(shí)電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或意義不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的,。一般來說，觀察時,，除了放大物體外,，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開來。如果兩個相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下,，即使放大很大程度,，也可能看到兩個相交的亮點(diǎn)(艾里斑),，沒有明顯的邊界(更不用說細(xì)節(jié)了)，說明分辨率不夠,。沒有分辨率談放大是沒有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，大約是光波波長的一半,。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限,，但準(zhǔn)確的說應(yīng)該叫分辨率極限。原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性,。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動性，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的,。電子顯微鏡也有很多種,，被攝體像REM。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡,，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM),。兩者主要用于觀察晶體，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像,，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實(shí)空間,，即可得到真實(shí)的晶體表面像。國外熒光激光雙光子顯微鏡光刺激